毛囊干细胞表皮膜片修复裸鼠皮肤缺损的实验研究

张 群 杨光辉 丛笑倩 崔 磊 张文杰 刘 伟 曹谊林

毛囊干细胞表皮膜片修复裸鼠皮肤缺损的实验研究

张 群 杨光辉 丛笑倩 崔 磊 张文杰 刘 伟 曹谊林

目的开发新的组织工程表皮替代物，利用毛囊干细胞-壳聚糖明胶膜片（Chitosan-gelatin membrane，CGM）进行修复裸鼠皮肤缺损的实验研究。方法将体外扩增培养的毛囊干细胞接种于CGM，构建组织工程表皮膜片，裸鼠背部作直径1 cm的全层皮肤缺损，将毛囊干细胞-CGM复合物覆盖创面。回植后1周、4周和12周分别进行组织学和免疫组织化学检测。结果毛囊干细胞在CGM上生长良好。毛囊干细胞－CGM修复裸鼠后1周切片示创面有新生上皮覆盖，表皮分化良好，而对照组残留较大未愈创面。修复后4周和12周可见对照组收缩较实验组显著。结论体外构建的毛囊干细胞-CGM可以修复裸鼠皮肤缺损。

毛囊干细胞壳聚糖明胶膜片皮肤缺损

表皮是人体与外界接触的第一道屏障，主要起保护防御功能，可防止体液丢失和病原体侵入。应用组织工程原理，将体外培养的上皮细胞接种于有良好生物相容性的支架材料上，经体外培养形成皮片，然后移植于烧伤、慢性皮肤溃疡等皮肤创面处，可实现创伤的修复和重建。但在临床应用中发现，移植物中缺乏干细胞导致疗效不佳。只有将干细胞融入组织工程化组织的构建之中，才有可能使得构建的组织移植回体内后能够长期存活，并维持自我更新的能力。研究发现，毛囊干细胞比毛囊间表皮干细胞更有增殖能力[1]，并具有慢周期性和巨大的增殖潜能，利用毛囊干细胞的无限增殖能力可以使创面得到完全修复，因此相关研究正日益受到关注。本实验将体外扩增培养的毛囊干细胞，接种于壳聚糖明胶材料（Chitosan-gelatin membrane，CGM）上构建组织工程表皮膜片，并用毛囊干细胞-CGM来修复裸鼠背部的全层皮肤缺损，进行毛囊干细胞修复皮肤缺损的探索性研究。

1 材料与方法

1.1 材料

整形外科手术废气的成人头皮15例；分离毛囊的器械包括眼科剪刀、镊子、解剖显微镜和显微器械；中性蛋白酶（Dispase，Gibco公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；Ⅳ型胶原涂被的培养皿；K-SFM(Define Keratinocyte Serum Free Medium)培养液，添加EGF和牛垂体提取物（Gibco公司）；鼠抗人单克隆抗体CK；兔抗人单克隆抗体LAMINE；Balb/c-Nu裸鼠（中科院上海斯莱克实验动物有限责任公司）。

1.2 方法

1.2.1 毛囊干细胞的分离与培养

毛囊干细胞的富集方法同文献[2]。

1.2.2 壳聚糖明胶膜片的制备

将含2%壳聚糖的乙酸溶液与4%的明胶溶液混合，室温下快速搅拌混合12 h，将一定量的混合液加入培养皿中，干燥成膜；将膜浸泡于20 mL含有2-吗啡乙磺酸的40%乙醇中30 min，弃去液体，30 mmol/L碳化二亚胺溶液反应2 h，大量蒸馏水洗涤24 h，二次干燥成膜。

1.2.3 表皮膜片的体外构建

将培养的毛囊干细胞按照0.5×106cells/cm2的密度接种于壳聚糖明胶膜片，培养在K-SFM培养液中，培养液每3天更换一次。

1.2.4 体外构建表皮膜片的检测

将体外培养的毛囊干细胞壳聚糖明胶膜片PBS冲洗2次后，2%戊二醛磷酸缓冲液固定，4℃保存。检测前PBS冲洗，1%锇酸固定，梯度乙醇脱水，醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，离子喷射仪喷金，扫描电镜观察。

1.2.5 裸鼠皮肤缺损的修复

选用4～6周龄裸鼠12只，速眠新麻醉，在背部正中作直径1 cm的全层皮肤缺损，置一皮肤隔离器于缺损边缘，防止裸鼠皮肤自身修复，创面覆盖同样大小的毛囊干细胞-壳聚糖明胶膜片，细胞面向下，打包固定。对照组则仅用壳聚糖明胶膜片直接覆盖。

1.2.6 回植表皮替代物的检测

手术后定期拍照，观察伤口愈合情况。回植后1周、4周和12周分别取材，石蜡包埋，制作组织切片，常规HE染色，石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度水化，置于湿盒内；0.25%Triton X-100，5%DMSO-PBS室温10 min；滴加0.75%/1.5%-PBS H2O2，37℃15 min；滴加10%羊血清，37℃30 min，吸去羊血清，加入一抗，鼠抗人广谱角蛋白，兔抗人Lamine抗体，工作浓度均为1∶100，置湿盒内4℃过夜；人成纤维细胞为阴性对照，空白对照仅滴加PBS液。第2天滴加二抗生物素化羊抗鼠和抗兔IgG；DAB(1∶50)显色；苏木素衬染，盐酸乙醇分化，常规脱水封片。

2 结果

2.1 毛囊干细胞—壳聚糖明胶膜片的构建

接种到CGM上的毛囊干细胞与CGM生物相容性好，细胞生长良好，保持上皮细胞特征，呈典型的“铺路石”状。扫描电镜示毛囊干细胞在CGM材料上粘附好，细胞仍保持典型的上皮样形态，细胞表面可见大量微绒毛（图1）。

2.2 修复裸鼠皮肤缺损

术后1周，将外敷料打开，揭去未降解的壳聚糖明胶膜片，在实验组可见创面干燥，有新生上皮覆盖创面，而对照组残留较大未愈创面。4周时，皮肤隔离器开始脱落，实验组未见明显收缩，对照组则收缩明显。12周后，可见实验组和对照组均有不同程度的收缩（图2）。

2.3 组织学

1周时，创面有新生上皮覆盖，表皮分化良好，新生表皮分为基底层、颗粒层和角化层3层结构，真皮内未见腺体样结构；对照组则无新生上皮形成，可见大量炎性细胞浸润。4周时，皮肤隔离器基本已脱落，创面与周边皮肤有明显的分界，实验组未见明显的创面收缩；对照组则见明显的收缩。HE染色示实验组和对照组均形成复层表皮结构，实验组表皮层厚、层次多。12周时，创面进一步收缩，尤以对照组剧烈。HE染色与4周时相似（图3）。

2.4 层粘连蛋白（Lamine）和广谱角蛋白（CK）检测

回植后1周、4周和12周分别取材做检测，实验组可见表皮基底层阳性表达Lamine，表皮层和角质层表达广谱角蛋白（图3）。

图1 毛囊干细胞在壳聚糖明胶膜片上生长良好

图2 术后不同时间观察

图3 修复后不同时间HE染色和免疫组织化学染色（200×）

3 讨论

组织工程表皮的研究经历了表皮细胞悬液、表皮细胞膜片和表皮细胞－生物材料复合物3个阶段。随着表皮细胞培养技术的不断完善与发展,组织工程表皮在成功救治大面积烧伤患者方面发挥了积极的作用，起到了早期覆盖并封闭创面的目的。但实验技术精细，培养周期长，培养的表皮细胞膜片易碎，不易操作，难以有效固定；移植到创面后成活率低；愈合后上皮组织弹性差，耐磨性差,易破溃和收缩；创面接受率低,只有50%～60%可永久存活，形成真皮不完整等。因此，开发适于表皮构建的细胞载体系统需要深入研究。

壳聚糖是从虾、蟹等海洋生物中提取的几丁质，经脱乙酰化后得到的一种天然多糖。结构及某些性质与细胞外基质中的主要成分氨基多糖极为相似，它具有高分子量和分子量分布单一，良好的生物相容性，生物可降解性等许多优点，在医学上应用非常广泛[3]。明胶是胶原的部分变性产物，有助于角质形成细胞在材料表面的增殖和迁移。壳聚糖-明胶材料可作为组织工程皮肤构建的支架材料[3-4]。

对于移植到创面上的皮肤替代物而言，能否被创面接受取决于创面本身的条件、皮肤替代物的情况（包括细胞的活力、所用的支架材料）、移植技术及移植后护理等诸多因素，其中细胞的活力尤为重要。因此，足量的干细胞对于组织工程皮肤替代物十分重要，它可以保证细胞的更新和移植物在创面上的长期存活。通过研究证实，毛囊干细胞具有自我更新、强大增殖和分化潜能，比表皮干细胞更具有增殖潜能[5-6]，如以毛囊干细胞作为种子细胞来构建皮肤，对于促进皮肤结构和功能的生理性修复有重大意义，更具发展前景和应用价值。

本实验选择壳聚糖和胶原部分变性的衍生物明胶构筑用于支持毛囊干细胞的固体载体系统，制备的壳聚糖-明胶材料与细胞外基质糖胺多糖（GAG）的结构类似，生物相容性好，可以支持毛囊干细胞的生长。培养在壳聚糖-明胶材料上的毛囊干细胞在移植后可以迁移到创面，并在创面继续生长、增殖和分化，最终形成结构完善的表皮结构。回植后的结果显示，移植物的创面接受率为100%，在移植后1周，实验组已分化形成复层表皮，而空白对照组只有炎性细胞浸润，无明显表皮形成。免疫组化显示，移植后1周实验组基底层Lamine和CK均呈阳性表达，说明已形成分化良好的表皮，移植后4周和12周的结果相似。创面回缩结果显示，实验组的创面回缩低于对照组，可能是实验组移植物中有较多的干细胞，可延长移植物在创面的存活时间，减少创面的回缩。

本实验采用人毛囊干细胞构建组织工程化表皮修复裸鼠的全层皮肤缺损，效果较好，但未发现皮肤附属器的形成。因为皮肤附属器的形成需要间充质和上皮间复杂的相互作用，虽然毛囊隆突部干细胞可以分化成表皮上皮所有的细胞系,但很可能在某一特定条件下只能分化成一种细胞系，局部特殊的位置或是细胞的微环境决定了细胞分化的选择，在合适的间质刺激因子的诱导下，毛囊间表皮干细胞才能够分化成毛发和皮脂腺的细胞系[7]。

应用毛囊干细胞作为组织工程化皮肤的种子细胞，如能建立完善的培养扩增体系，可以减少取材量。同时，实验证明，利用壳聚糖-明胶薄膜构建的毛囊干细胞载体，作为一种组织工程表皮替代物可以有效修复裸鼠皮肤缺损。

国内外研究均表明，单纯移植表皮由于缺乏真皮结构的支持，存在移植存活率低、韧性差、瘢痕收缩严重等问题，不能获得接近生理的皮肤愈合质量。采用组织工程技术复合构建包含表皮与真皮的人工皮肤应用于皮肤缺损创面的修复，是解决这一问题的较好途径。由于表皮层、真皮层之间的相互作用参与了创面修复，同时真皮的存在为血管新生和表皮覆盖提供了模板，因此移植的表皮和真皮保证了皮肤结构和功能的完整性，有助于加快皮肤再生及限制瘢痕组织形成。

随着细胞培养技术、生物支架材料学和免疫学等相关学科的发展，应用毛囊干细胞构建组织工程皮肤将显现出巨大的发展前景和临床应用价值。

[1]Taylor G,Lehrer MS,Jensen PJ,et al.Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis [J].Cell,2000,102(4):451-461.

[2]张群,杨光辉,丛笑倩,等.人毛囊外根鞘细胞的分离及培养[J].组织工程与重建外科杂志,2006,2(2):79-82.

[3]杨光辉,杨军,邓辰亮,等.组织工程化表皮膜片修复裸鼠创面的实验研究[J].上海第二医科大学学报,2004,24(4):293-295.

[4]杨军,杨光辉,刘伟,等.组织工程化表皮膜片的构建及其在增殖性瘢痕治疗中的应用[J].上海第二医科大学学报,2004,24(4): 296-298.

[5]Morris RJ,Potten CS.Highly persistent label-retaining cells in the hair follicles of mice and their fate following induction of anagen [J].J Invest Dermatol,1999,112(4):470-475.

[6]Oshima H,Rochat A,Kedzia C,et al.Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells[J].Cell,2001, 104(2):233-245.

[7]伍津津,吴先林.表皮干细胞的定向分化:隆突激活假说的新认识[J].中国临床康复,2003,7(4):584-585.

An Experimental study of human hair follicle stem cells-chitosan-gelatin membrane for repairing the skin defect of nude mouse

ZHANG Qun,YANG Guanghui,CONG Xiaoqian,CUI Lei,ZHANG Wenjie,LIU Wei,CAO Yilin.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:CAO Yilin

ObjectiveTo develop a new tissue engineering(TE)-epidermal substitute by using the hair follicle stem cells-chitosan-gelatin membrane（CGM）to repair skin defects of the nude mouse.MethodsA full-thickness skin defect was made on the dorsum of nude mouse.The hair follicle stem cells were inoculated and on the CGM,the hair follicle stem cells-CGM was constructed to repair the skin defects of nude mouse.A full-thickness skin defect was only covered with chitosan-gelatin membrane in the control group.The nude mice were sacrificed 1,4,12 weeks respectively after the operation. The grafts were examined by HE and immunohistology staining.ResultsThe hair follicle stem cells grow well on the surface of CGM.1 week after operation,a new epidermal covered the surface of the skin defects.HE showed the welldifferentiated keratinocytes of new epidermal;The unhealed wound was found 4,12 weeks after transplantation in the control group and the contraction of the skin was significantly greater than the experimental group.ConclusionThe hair follicle stem cells-chitosan-gelatin membrane is an ideal cell source for repairing the skin defect in nude mouse.

Human hair follicle stem cells;Chitosan-gelatin membrane;Skin defect

Q813.1+2

A

1673－0364（2009）－02－0079－04

2008年8月12日；

2009年12月23日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.04.005

国家高技术发展计划项目（863）（2003AA205120，2003AA205122）。

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

曹谊林。