转染人血管内皮生长因子基因的组织工程骨修复眼眶壁骨缺损的实验研究

肖彩雯 范先群 周慧芳 毕晓萍 沈 琴 王业飞

转染人血管内皮生长因子基因的组织工程骨修复眼眶壁骨缺损的实验研究

肖彩雯 范先群 周慧芳 毕晓萍 沈 琴 王业飞

目的探讨以转染人血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF）基因的骨髓基质干细胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）构建的组织工程骨在犬眼眶壁骨缺损中的修复效果。方法体外分离扩增犬自体BMSCs至第2代，用腺病毒转染VEGF基因。采用Real－time PCR和Western Blot检测目的基因和蛋白表达情况。细胞接种在珊瑚支架材料上构建组织工程骨，Elisa检测转基因细胞在支架材料上的蛋白持续表达情况。成年比格犬24只，双侧眼眶内侧壁制造直径12 mm圆形骨缺损模型，随机分为4组：A组植入转染VEGF的组织工程骨，B组植入未转染基因的组织工程骨，C组植入单纯珊瑚材料，D组为旷置组。分别在手术后4周、12周、24周取材，行大体观察、Micro－CT分析、免疫组化方法检测血管形成情况，以及组织学观察和组织形态学检测比较骨缺损修复效果。结果VEGF基因修饰的BMSCs能够高表达目的基因和蛋白，构建组织工程骨后能够在体外持续分泌VEGF蛋白22 d。C组和D组均未修复眶壁骨缺损。A组在骨缺损修复过程中，4周时的新生血管形成量和新生骨体积明显高于B组（P＜0.05），但12周、24周时两组的新生血管量和新生骨量均无显著性差异（P＞0.05）。结论转染VEGF的BMSCs构建的组织工程骨体内回植后早期能够促进新生血管形成，加速新骨生成。

血管内皮生长因子骨髓基质干细胞组织工程骨血管化眶壁骨缺损

骨组织工程以生长因子、种子细胞和载体支架为基础，模拟了体内骨再生的过程。近年来，大量动物实验证实，组织工程骨能够修复或部分修复多种部位的骨缺损，展示了其临床应用的美好前景。但组织工程骨植入体内后，距离毛细血管200 μm以上的细胞将因为缺乏养分和氧气而不能存活[1]，影响了组织工程骨的体内存活率，无法满足临床治疗的需求。如能实现组织工程骨的早期血管化，种子细胞将能尽早获得营养供应，从而可使更大体积的组织工程骨得以存活进而修复缺损。因此，促进组织工程骨血管化的研究越来越引起人们的关注。

血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种血管内皮细胞特异性有丝分裂原，存在5种不同形式，分别由121、165、145、189和206个氨基酸组成。其中VEGF 165以可溶性的形式存在，或与细胞膜、基底膜或细胞外基质含有肝素的糖蛋白结合，是人体内主要的分泌形式和效应分子。由于VEGF在体外能促进内皮细胞生长，在体内可诱导血管发生[2]，因此本实验利用体外转基因技术,将VEGF 165基因导入犬骨髓基质干细胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）,使之稳定表达和分泌VEGF。然后以转基因的自体BMSCs为种子细胞，构建组织工程骨，回植体内修复眶内侧壁标准骨缺损，观察其能否通过加速血管形成促进骨缺损的修复。

1 材料与方法

1.1 实验材料

α－MEM培养基、胰蛋白酶、小牛血清购自美国Gibco公司，VEGF 165腺病毒表达载体（Ad－VEGF）和携带β－半乳糖酐酶基因的腺病毒对照载体（Ad－Lacz）由上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科实验室构建成功。通过感染293细胞扩增病毒,病毒噬菌斑形成试验测定滴度。

图1 实验所用珊瑚材料的大体观察（A）、Micro-CT三维重建图像（B）和电镜照片（C）

支架材料（天然珊瑚多孔材料）购自北京创意公司,孔径250～350 μm，孔隙率＞90%,根据眼眶内侧壁的形状制成高度为3 mm的圆锥状（一侧截面直径为12 mm，另一侧为10 mm）（图1）。超声清洗、60Co消毒后备用。

1.2 BMSCs的获取、培养及转染

按照文献[3]的方法进行BMSCs的获取、分离、培养和传代。在第2代细胞融合达到50%～70%后，以重复感染倍数（Multiplication of infection，MOI）为150进行病毒转染，转染时间为12 h，换液后继续培养。培养后24 h用5溴－4氯－3吲哚－β半乳糖苷（X－gal）特异性染色，能产生蓝绿色沉淀的细胞为已经转染Ad－Lacz细胞。基因转染24 h和72 h后，分别进行Real－time PCR和蛋白印迹法(Western Blot)检测目的基因和蛋白表达情况。

1.3 体外构建组织工程骨

珊瑚材料预湿过夜，将转基因的BMSCs制成1×107cells/mL的细胞悬液，将细胞悬液缓慢地从不同侧面滴入珊瑚材料（每块材料500 μL）,置于CO2培养箱孵育3～4 h后，加入培养液继续培养。每日抽取细胞材料复合物培养液，Elisa法检测目的蛋白VEGF分泌情况。材料接种细胞后，1 d、3 d、7 d各取一块以扫描电镜观察细胞在材料上附着生长情况。组织工程骨体外培养5 d后行自体体内回植。

1.4 动物分组和手术方法

成年比格犬24只，雌雄不限，静脉氯氨酮麻醉，侧卧位。双侧眼部常规消毒、铺无菌巾，切开眶下缘皮肤、分离肌肉、切开眶下缘骨膜，向鼻内侧分离暴露眶内侧壁。双侧眼眶内侧壁（眶缘内0.5 cm）制造直径12 mm圆形骨缺损模型（图2），共计48例，随机分成4组。A组：植入转染VEGF的自体BMSCs构建的组织工程骨；B组：植入未转染基因的自体BMSCs构建的组织工程骨；C组：植入单纯珊瑚组；D组：旷置组（每组n=12）。可吸收缝线缝合眶缘处骨膜，5－0丝线缝合皮肤。术后连续3 d肌肉注射青霉素40万单位，每日2次。

图2 缺损模型的制备和缺损修复

1.5 大体观察和Micro－CT检查

分别在手术后4周、12周、24周各取材8只动物，标本行大体观察后，采用Micro－CT（瑞士Scanco Medical公司）摄取断层影像，扫描厚度40 μm，阈值设置为200 mgHA/cm3（毫克羟基磷灰石/立方厘米），测定并比较标本骨缺损处的新生骨体积之间的差异。

1.6 免疫组化检测和组织形态学测定

所取标本分为对称的两部分，一部分以多聚甲醛固定，EDTA脱钙，脱水，石蜡包埋切片，用抗狗的CD31抗体标记骨缺损区的新生血管内皮细胞。连续切片（每组织块5张），每张切片随机选取5个视野，200倍显微镜下计数微血管数量，以阳性的单个细胞或一簇细胞作为1个微血管。

另一部分标本乙醇梯度脱水，甲基丙烯酸甲基酯单体包埋，硬组织切片，Van Gieson染色。观察骨组织形成情况。

1.7 统计学处理

采用SPSS 16.0软件包进行单因素方差分析，数据以均数±标准差表示,两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs转染后目的基因后生物学检测

第2代BMSCs生长至50%～70%融合时，用MOI=150∶1的倍率行基因转染，经X-gal特异性染色证实转染效率能达到95%以上。基因转染前后细胞形态没有明显的改变。转染基因后Real-time PCR和Western Blot检测证实VEGF目的基因和蛋白的表达量均升高（图3）。

图3 Real－time PCR（A）和Western Blot（B）检测目的基因和蛋白的表达情况，可见基因转染组的表达量增高（＊：P＜0.05）

2.2 细胞在材料上的增殖

Elisa证实，细胞接种材料后，BMSCs能持续22 d稳定分泌VEGF目的蛋白(21.52±1.85 ng/106cells/d)。扫描电镜观察，细胞接种材料1 d后可见细胞呈成纤维细胞样黏附于珊瑚表面，均匀分布，细胞伸展良好，有较长突起，珊瑚孔隙中有分泌的细胞外基质填充。随着培养时间的延长，可见珊瑚材料上的细胞数量与胞外基质均明显增多（图4）。

图4 细胞接种材料1 d（A）、3 d（B）、7 d（C）扫描电镜观察，可见珊瑚材料上的细胞数量与胞外基质随时间延长明显增多

2.3 术后大体观察和Micro-CT检测

实验动物在术后的前3 d出现手术区组织水肿，1周后水肿基本消退。拆除眼睑皮肤缝线，皮肤切口愈合良好。实验期间未见修复材料排出、移位、伤口感染等局部并发症。

图5 术后4周、12周、24周取材行Micro－CT检查和大体观察

取材时大体观察，①术后4周：A组，珊瑚材料部分降解吸收，边缘与周围的正常眶骨结合较紧密，鼻窦面为完整的粘膜覆盖；B组，材料部分降解，眶内侧面形成类白色的骨组织和材料的混合物，鼻窦面形成完整的粘膜；C组，珊瑚材料体积变小，与缺损边缘形成纤维结缔组织；D组，骨缺损的锐性边缘变圆钝，缺损区为纤维组织填充。②术后12周：A组，骨缺损周边形成菲薄的新生骨组织，中央被覆半透明的结缔组织；B组，部分缺损区内新骨形成，部分则为纤维结缔组织，内有未降解完全的材料残余；C组，珊瑚材料大部分吸收，被纤维结缔组织替代；D组，3例鼻窦侧的筛状骨质增生，表面形成白色膜样结缔组织，1例缺损区中央变黑，没有组织覆盖。③术后24周：A组，部分骨缺损完全被新生骨替代，但中央区为纤维组织；B组，缺损的边缘新生骨相互连接但不能完全填补骨缺损，中央或偏中央区为软组织；C、D组：缺损大部分为纤维组织所填充，边缘有少量骨组织形成，下方的筛状骨增生（图5）。

Micro－CT检测，①术后4周：A组、B组的珊瑚材料部分降解，而C组的材料大部分未降解。②术后12周：A组材料已完全降解吸收，缺损区有新生骨组织生成；B组大部分材料已降解，缺损区部分被新生骨组织填充，C、D两组的骨缺损边缘有少量骨组织向中央爬行。③术后24周：A、B组大部分缺损为骨组织修复，但中央区域仍未修复；而C、D两组则表现为骨不连（图5）。

对比新生骨组织的体积，A组（16.38±1.66 mm3）在4周时显著高于B组（9.34±2.02 mm3）（P＜0.05），在12周、24周时差异没有统计学意义（P＞0.05）。而在各检测时间点，A、B组的新生骨量均远多于C、D组。

2.4 免疫组化和组织形态学检测

用抗狗的CD31标记骨缺损区的新生血管，免疫组化检测可见新生血管呈棕色圆环状，血管内的红细胞非特异性显示为浅棕色。4周时血管数量计数，A组为（20.5±2.65），大于B组的（13.5±2.38）（P＜0.05）（图6）。12周、24周时两组的新生血管数目则无统计学差异。而在各检测时间点，A、B组的新生血管数量均远大于C、D组（P＜0.05）。

图6 免疫组化染色可见转染VEGF组（A）有大量的血管生成，而未转染组（B）血管形成量明显减少

组织学检查可见：A、B组4周时有类骨质围绕珊瑚材料形成，12周时有大量编织骨形成和生长活跃的骨细胞，新生骨和散在的尚未降解的珊瑚微粒并存；24周时珊瑚完全降解消失，新生骨的结构发生改建，有哈佛氏系统形成。但两组的新生骨均未能完全修复骨缺损。C组4周时缺损区大部分为珊瑚材料，仅在骨缺损边缘见到少量类骨质向材料内部生长；12周时，珊瑚材料大部分降解，缺损边缘有少量新生骨组织，而中央筛窦侧骨质增生；24周时，材料全部降解，骨缺损未修复。D组4周时骨缺损处为空白，12周时骨缺损下方的鼻窦粘膜基本覆盖缺损（筛状鼻窦有少量新生骨组织生成），24周时缺损中央仍为空白区域（图7）。

图6 转染VEGF基因的组织工程骨术后组织学检查

3 讨论

随着交通事故的增多，眼眶外伤所致的眼眶骨缺损的发病率正在逐年上升。眼眶骨缺损不仅会导致颅颌面部畸形，而且会造成眼球移位、视功能障碍。自体骨移植一直被认为是眼眶骨缺损修复的金标准[4]。但移植自体骨时会导致供区缺损，而且不能塑形，很难精确地重建眼眶[5]。目前临床常用的修复方法是将修复材料桥架在骨缺损部位之上，但材料存在感染和排异的隐患。

本研究试图将组织工程技术引入眼眶壁的修复重建中，其目的是促进缺损区的新生骨组织生成，达到真正的形态和功能的修复。但是眼眶骨缺损的修复过程不同于其他部位，眼眶骨缺损处的骨膜也易受到损伤，或随骨折片陷入副鼻窦或逐渐萎缩、纤维化，造成该部位的血液供应很差。该部位一面是眶内的软组织，另一面是副鼻窦的窦腔。而在副鼻窦粘膜完全修复之前，窦腔侧的细胞很难获得营养供应。因此，解决组织工程骨的血管化问题成为决定组织工程骨能否修复眼眶壁骨缺损的关键因素。

目前促进组织工程骨血液供应的方法主要有：①血管束移植：利用显微外科技术，植入带血管蒂的筋膜瓣或带血管束的组织工程骨；②应用生长因子，如VEGF促进血管生长；③血管内皮细胞联合成骨细胞与支架材料复合。预构血管化的组织工程骨还处于研究阶段，尚不能有效供给种子细胞营养物质。大量研究证明，VEGF能有效地促进血管生长[2，6－7]。因此，本实验试图通过提高VEGF的水平来促进组织工程骨的血管化进程，进一步观察血管化的提高是否能促进眼眶部位的骨组织修复。

VEGF在体内的生物半衰期短暂，静脉输入时半衰期仅为3～6 min，远远短于产生效应所需的时间，无法达到持久、稳定、有效的血管生成作用。利用基因工程方法将各种生长因子基因转入细胞,能够在特定时间内长期分泌生长因子，可有效地促进血管的再生。因此采用基因转移技术将VEGF基因转入骨组织工程的种子细胞中，有可能为血管化组织工程骨的构建与应用提供新的方法与思路。我们通过将自体的BMSCs转染VEGF，使之在体外能高表达目的蛋白；回植体内后免疫组化检测到转染组在早期确实形成了更多的新生血管，证实通过基因转染的方式能够增强组织工程骨的早期血管化的能力。

研究表明，阻断内源性VEGF的活性，骨形成与骨吸收就将终止[8]。Street等[9-10]通过受体阻断成骨细胞分泌的VEGF，能阻止骨组织的修复，外源性加强VEGF后，能明显促进骨组织的愈合。本研究发现，4周时基因转染组新生血管数量和新生骨量均多于未转染组，表明在转基因组的早期成骨能力得到提高，经VEGF基因转染修饰的BMSCs表达的VEGF可通过自分泌方式发挥强大的生物学效应，促进局部血管生成，为成骨提供更有利的微环境，增强成骨活性；在12周和24周时，发现转染基因组和未转染组的新生血管量和新生骨量没有明显的差别，考虑可能有以下原因：①我们通过复制缺陷性腺病毒将VEGF 165基因转染入BMSCs，目的基因未整合到染色体内，目的蛋白的表达时间相对较短。同时腺病毒载体构建组织工程骨植入体内后有可能刺激机体的免疫系统，加速转基因细胞的吞噬，致使目的蛋白表达时间进一步缩短。因此，12周和24周时外源基因没有得到加强，成骨能力和未转染基因组不再存在差别。②血管形成是一个复杂的过程，新生血管在VEGF的刺激下形成了较多的新生血管，但随着VEGF的表达量减少，部分新生血管逐渐萎缩，所以在12周和24周检测血管的数量并没有差别。

本实验方法早期能够促进新生血管和新生骨的形成，但长期效果并不明显，有待进一步研究。

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VEGF Gene Transfected Human BMSCs Acting as Seeding Cell for Tissue Engineering Bond in Orbital Wall Bone Defects

XIAO Caiwen,FAN Xianqun,ZHOU Huifang,BI Xiaoping,SHEN Qin,WANG Yefei.
Department of Ophthalmology, Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:FAN Xianqun.

ObjectiveTo investigate the effect VEGF－gene transfected BMSCs to construct tissue engineered bone in the treatment of orbital wall bone defects.MethodsIn vitro isolated and expanded BMSCs of passage 2 were transfected with adenoviruses containing human VEGF gene,and the target gene expression was evaluated by Real－time PCR and Western Blot.BMSCs were harvested and seeded into the coral scaffolds to construct tissue engineered bone.VEGF protein secretion from the cells was detected using Elisa method.Bilateral orbital wall circular defects(12 mm in diameter)were created in 24 adult beagles dogs.The dogs were divided into 5 groups,the group trasfected by VEGF(Group A),the non－transfected group (Group B),the group implanted coral alone(Group C),and blank group(Group D).Animals were sacrificed at 4,12 and 24 weeks post－implantation,and the repairing effect was evaluated by gross observation,Micro－CT,immunohistochemistry,and histomorphometric analysis.ResultsVEGF gene expression was regulated after gene transfection,and protein secretion was detected 22 days after cell seeding.No repair was found in Groups C and D.The number of new blood vessel and volume of new bone were significantly higher in Group A than in Group B at 4 weeks after implantation(P＜0.05),but no statistically significant at 12 and 24 weeks(P＞0.05).ConclusionTissue－engineered bone composed of VEGF－expressing BMSCs could enhance the formation of blood vessel and bone at early periods in vivo.

Vascular endothelial growth factor;Bone marrow stromal cells;Tissue engineered bone;Vascularity; Orbital wall bone defect

Q813.1+2，R687.3+4

A

1673－0364（2009）－02－0065－05

2009年1月23日；

2009年3月1日)

10.3969/j.issn.1673－0364.2009.04.002

上海市重点学科建设项目（S30205），上海交通大学博士创新基金（BXJ0826），上海市自然科学基金（08zr1412900）。

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科。

范先群。