肝细胞生长因子基因修饰间充质干细胞治疗股骨头坏死的探索性研究

楼 晓 宫恩年 商丰元 魏成刚 施志超 汪劲松 吴祖泽 郭子宽

肝细胞生长因子基因修饰间充质干细胞治疗股骨头坏死的探索性研究

楼 晓 宫恩年 商丰元 魏成刚 施志超 汪劲松 吴祖泽 郭子宽

目的探讨肝细胞生长因子基因修饰自体骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死的可行性，并评价其疗效。方法对1例ARCOⅢB股骨头坏死患者，手术过程中局部注射肝细胞生长因子基因修饰的自体骨髓间充质干细胞1×107个，随访观察评价其临床疗效和影像学改变。结果治疗过程顺利，术后无感染及过敏等严重并发症发生。术后随访9个月，患者髋关节疼痛指数较治疗前明显降低，髋关节临床症状Harris评分分值由治疗前的63分提高到治疗后的76分，髋关节活动度Harris评分由治疗前分值2.5分提高至4.2分。CT扫描显示损伤局部出现重建性骨修复，低密度区范围缩小，密度增高。ARCO分期由ⅢB改善至ⅢA。结论肝细胞生长因子基因修饰的自体骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死，安全有效，本次探索为进一步临床研究奠定了基础。

股骨头坏死间充质干细胞肝细胞生长因子

股骨头坏死（Osteonecrosis of the femoral head， ONFH）是临床常见病，多发于青壮年，严重影响劳动能力和生活自理能力。多数患者不得不行人工关节置换，而中青年患者的关节置换手术后，仍需再次更换，且长期疗效难以预测[1]。因此，现在多主张早期保守治疗，阻止病情进展，以避免或延缓人工关节置换[2]。

股骨头坏死基本病理变化包括两个方面：①由于外伤、药物和其他因素引起的微循环障碍，导致股骨头血液供应不足；②血供障碍引起骨组织损伤坏死，继发骨性关节炎，关节功能丧失。因此，ONFH恰当的治疗措施必须将促成骨和促血管新生有机地结合起来[3]。本研究将利用重组肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）腺病毒感染自体骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs），将HGF的促血管新生功能和MSCs的成骨功能结合起来，通过细胞治疗的手段，进行骨损伤修复，为治疗ONFH提出一个新的思路。

1 材料与方法

1.1 病例资料

患者，女，48岁，术前髋关节酸痛，活动受限，跛行，病程5年。CT扫描示股骨头骨质疏松，骨硬化及囊性变，关节囊肿胀、积液。曾有激素药物治疗史。根据世界骨循环研究学会（ARCO）的国际骨坏死分期标准[4]，诊断为右侧股骨头坏死ⅢB。患者同意接受肝细胞生长因子基因修饰的自体骨髓间充质干细胞治疗，并签署知情同意书。

1.2 自体骨髓MSCs的分离培养和MSCs－HGF的制备

利多卡因局麻下自髂后上棘处行骨髓穿刺，以预含2 mL肝素钠（100 U/mL）的10 mL注射器抽取骨髓10 mL，于GMP级细胞实验室中的超净工作台内稀释骨髓液，加于淋巴细胞分离液，行密度梯度离心，获得骨髓单个核细胞，以2×105cells/cm2的密度接种于含2.5%血小板裂解物（Platelet lysates，PL）的α－MEM培养基的塑料平底培养瓶中。37℃、5%CO2、饱和湿度的孵箱中静置培养48 h后，去除非贴壁细胞。细胞生长至80%融合时，以0.05%的胰蛋白酶进行消化、传代和扩增。达到所需细胞数目时，在无血清培养体系中按MOI=150∶1加入Ad－HGF腺病毒载体，48 h后收获细胞，称为MSCs－HGF，计数1.0×107个后立即用于植入治疗。

1.3 植入方法

在持续硬脊膜外麻醉下，患者接受明胶海绵填塞术，术中局部注射MSCs－HGF细胞悬液2 mL，常规缝合。

1.4 术后处理

术后去枕平卧6 h，监测体温、脉搏、呼吸及血压等变化，注意观察切口，必要时更换敷料。术后3个月内不能负重，3个月后扶拐负重，期间进行常规的肌肉功能锻炼，定期复查髋部X线片、MRI和CT扫描。

1.5 随访与评价

术后随访患者，根据WOMAC评价标准[5]，对髋关节疼痛进行评价，疼痛程度则以目视类比式测量器（VAS）进行测量（0～100分）。

随访时复查髋部X线片和CT扫描，并与术前资料对比，给予髋关节功能Harris评分（HHS），进行疗效评价[6－7]，HHS＞90分为优，75～90分为良，60～74.9分为可，＜60分评定为差。同时计算髋关节活动度HHS分值，评价项目包括关节屈、伸、展、收、旋转度，并根据影像学改变再次进行ARCO分期。

2 结果

患者手术顺利，术后无感染、过敏、血管神经损伤等并发症发生，切口愈合好，髋部疼痛减轻。用CPM关节被动练习一周后，扶拐下床活动。

对患者进行了术后3个月和9个月的两次随访，复查髋部X线片和CT扫描，术前股骨头局部塌陷，关节面部分消失，股骨头内见囊性变及硬化边。术后CT扫描显示出现重建性骨修复，低密度区范围缩小，密度增高，骨小梁和新骨生成，股骨头局部塌陷重新隆起，消失的关节面大部分恢复（图1）。术后9个月，ARCO国际骨坏死分期为ⅢA。

图1 治疗前后的患髋X线片和CT扫描评价

髋关节疼痛指数变化：患者术前疼痛指数是56，术后3个月和9个月时疼痛指数分别是48、42，疼痛指数明显降低（图2）。

图2 治疗前后的疼痛指数评价

患侧髋关节进行Harris评分：髋关节临床症状HHS分值由治疗前的63分显著提高到治疗后的76分，髋关节活动度HHS分值由治疗前的2.5分提高至治疗后的4.2分（图3）。

图3 治疗前后的Harris评分

3 讨论

股骨头坏死是由于多种病因破坏股骨头的血供，使骨的活性成分（包括骨细胞、骨髓细胞和脂肪细胞）死亡所引起的一个病理过程，随后机体对坏死区进行自然修复，坏死骨小梁被逐步吸收，股骨头力学强度下降，塌陷变形，从而导致骨性关节炎和髋关节功能的严重损伤[8]。其病因大致分为创伤性和非创伤性两大类。目前对于股骨头坏死的治疗主要有非手术保守治疗、姑息性手术治疗和人工关节置换。人工关节置换术主要用于晚期继发髋关节骨性关节炎的患者且受病变程度、年龄和人工关节使用寿命等因素的制约，因而并非是首选方法[9]。ONFN的理想治疗应在早期阻止骨质继续坏死，促进骨再生，改善股骨头内血液循环，防止塌陷，改善临床症状，延缓进行人工髋关节置换的时间。然而，早期治疗方法虽多，但尚无一种方法能取得满意的效果[10]。近年来，随着生物治疗理论和骨组织工程学的不断发展，一些新型临床技术逐渐得到应用并取得较好的效果。

近期研究已发现，股骨头坏死与局部MSCs增殖能力下降或活力不足相关[11]。干细胞研究是生命科学的热点，也越来越显示出对临床医学进步的革命性推动作用。间充质干细胞是目前应用广泛的一类成体干细胞，可向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞分化，是骨组织工程研究的最佳种子细胞[12-14]。由于其分离培养简便，低免疫原性，分泌多种成骨活性因子，能在骨损伤坏死局部促进爬行替代和新骨形成，间充质干细胞已被美国FDA批准应用于多项骨损伤修复的临床试验中[15]。

髓芯减压可以暂时降低骨内压，延缓早期骨坏死的自然过程，但并没有彻底解决股骨头的修复问题。骨内压升高的恶性循环会不断降低股骨头生物强度，最终导致股骨头塌陷[16]。在本病例中，治疗后9个月，CT扫描显示出现重建性骨修复、低密度区范围缩小、密度增高、骨小梁和新骨生成、股骨头局部塌陷重新隆起、消失的关节面大部分恢复，HHS分值提高，ARCO分期由ⅢB改善至ⅢA，这证实了MSCs-HGF的体内骨修复能力。

目前有关干细胞治疗股骨头坏死的报道绝大多数为直接局部注射骨髓单个核细胞，罕见运用分离培养的间充质干细胞进行治疗[3]。事实上，骨髓中间充质干细胞含量很低，约为105～106分之一，因此必须经过体外扩增才能达到治疗剂量，发挥相应生物效应。我们的动物研究已表明，MSCs可以促进骨缺损部位的骨形成[17]。

坏死部位普遍存在缺血、缺氧、缺乏营养的不利环境，不利的局部环境势必影响植入细胞的生存、再生、分化和修复，难以取得预期效果。因此，针对股骨头坏死的生物治疗，除纠正成骨缺陷，还应包含促进血管新生、改善局部血供的策略。肝细胞生长因子是一种可引起多种细胞生物学效应的细胞因子，与其受体c-MET结合后，能激活MAPK、PI3K、鞘氨醇激酶等多种细胞内信号途径，发挥促细胞增殖、促细胞迁移、抑制细胞凋亡、促血管新生、抗纤维化和修复组织损伤等生物学作用[18]。我们之前的研究证实，MSCs-HGF拥有比MSCs更好的抗低氧损伤能力[17]。本研究利用我室研制的Ad-HGF腺病毒载体，转导MSCs，从而将HGF的促血管新生、促细胞增殖作用与MSCs的条件成骨能力有机结合，发挥有效的骨修复效应。这是国内首次MSCs-HGF治疗股骨头坏死的临床应用，并取得令人欣喜的疗效，必将进一步推动股骨头坏死生物治疗的研究与实践。诚然，相关的临床治疗方案仍需进一步探讨和规范，以期扩大病例数，使之成为一种常规的临床新技术。

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Exploratory Research for Hepatocyte Growth Factor Gene-Modified Mesenchymal Stem Cells on Femoral Head Osteonecrosis

LOU Xiao1,GONG Ennian2,SHANG Fengyuan2,WEI Chenggang2,SHI Zhichao2,WANG Jinsong1,WU Zuze1,GUO Zikuan1.
1 Institute of Radiation and Irradiation Medicine,Academy of Military Medical Science,Beijing 100850,China;2 66400 Orthopaedic Hospital of PLA,Beijing 100143,China.Corresponding author:GUO Zikuan.

ObjectiveTo explore the clinical feasibility and therapeutic effect of mesenchymal stem cells modified by hepatocyte growth factor gene for treating femoral head osteonecrosis.MethodsAutologous bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)from one patient with osteonecrosis of the femoral head in a stage of ARCOⅢB were separated and expanded in vivo.Cells were modified by an adenoviral vector carrying human hepatocyte growth factor gene,and total cells of 1.0×107were surgically implanted into the necrotic sites of the affected femoral head.During the nine-month follow-up,the clinical symptoms and imaging change were evaluated.ResultsNo any severe complications that without obvious infection and allergy were observed.After nine months,there was a significant reduction in hip joint pain measured with the WOMAC index.The Harris scores of hip joint were obviously improved,which indicated respectively for clinical symptoms(63 versus 76)and for joint range of motion(2.5 versus 4.2).Computer Tomography displayed reconstructive repair manifestation,which exhibited as decreased low-intensity region accompanied with new bone formation.The classification of disease severity was improved from stage-ⅢB to stage-ⅢA,according to the system of the Association Research Circulation Osseous.Conclusion Implantation of autologous MSCs modified by hepatocyte growth factor gene was one of safe and effective treatment for osteonecrosis of the femoral head.Our results here might provide supportive data for further large scale clinical trials.

Femoral head necrosis;Mesenchymal stem cells;Hepatocyte growth factor

R683.42

A

1673－0364（2009）－02－0083－04

2008年12月22日；

2009年1月25日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.04.006

国家高技术研究发展计划（863项目）（2007AA02Z454）。

100850北京市军事医学科学院放射与辐射医学研究所（楼晓，汪劲松，吴祖泽，郭子宽）；100143北京市北京66400部队骨病医院（宫恩年，商丰元，魏成刚，施志超）。

郭子宽。