萤火虫荧光素酶报告基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

边素艳 盖鲁粤 叶 平 杨月峰 王荣亮 王 华 郭子宽 王立生

萤火虫荧光素酶报告基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

边素艳 盖鲁粤 叶 平 杨月峰 王荣亮 王 华 郭子宽 王立生

目的构建含萤火虫荧光素酶报告基因的逆转录病毒载体，为进一步研究生物发光活体动物体内光学成像奠定基础。方法利用重组DNA技术，将荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic双酶切得到的目的基因fluc+亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中，重组质粒pL(fluc)SN在脂质体介导下“乒乓”转染GP+E86和PA317包装细胞，G418筛选，直至出现抗性克隆。扩大培养，测定病毒滴度，并检测荧光素酶活性。结果经限制性酶切分析鉴定，载体插入基因大小、位置均正确，并用GP+E86和PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选，建立具有较高滴度的重组逆转录病毒fluc细胞系，该细胞可高效表达荧光素酶。结论成功构建了重组质粒pL(fluc)SN，为标识干细胞进行基础研究提供了一种检测方法和平台。

荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic重组逆转录病毒载体pLXSN构建

生物发光活体成像技术是应用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或DNA，利用一套非常灵敏的光学检测仪器，可监控活体生物体内的细胞活动和基因行为的技术[1]。用生物发光活体成像技术可实现对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，所得的数据更加真实可信，且不涉及放射性物质和方法。该方法操作简单、结果直观、灵敏度高，为多种肿瘤细胞和病原体的体内示踪、免疫细胞和干细胞移植后生物学行为、细胞凋亡等研究开辟了新的方法和研究平台[2-4]。本研究旨在构建萤火虫荧光素酶报告基因重组逆转录病毒载体，筛选稳定表达荧光素酶报告基因的逆转录病毒包装细胞，为进一步用生物发光活体成像方法，研究经体外修饰细胞的体内示踪奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

E.coli DH5α、离心柱型普通质粒小提试剂盒、超薄离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生物化学试剂公司。SmaⅠ、Bam HⅠ、HpaⅠ等限制性内切酶、T4DNA连接酶购自Takara公司。pLXSN逆转录病毒表达载体（图1A）、荧光素酶报告基因载体－pGL3－Basic（图1B）、逆转录病毒包装细胞PA317、GP+E86细胞由军事医学科学院提供。脂质体转染试剂盒Lipofect amine 2000购自Invitrogen公司。G418购自Gibco公司。Bright－GloTMLuciferase AssaySystem购自Promega公司。DMEM购自Hyclone公司。小牛血清购自元享生物研究所。

图1 质粒图谱（引自Clontech公司）

1.2 方法

1.2.1 pL(fluc)SN构建及酶切鉴定

首先制备线性化粘平末端的pLXSN载体。用Bam HⅠ和HpaⅠ双酶切载体pLXSN，37℃、2 h后以0.8%琼脂糖凝胶电泳，并用离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体片段。再制备线性化粘平末端的fluc基因片段。用Bam HⅠ、SmaⅠ双酶切pGL3－Basic，37℃2 h后以0.8%琼脂糖凝胶电泳回收大小约1 976 bp的基因片段fluc。用T4 DNA ligase将上述fluc基因片段与线性化粘平末端的pLXSN载体片段以3∶1的比例于37℃下连接反应3 h。最后制备DH 5α感受态宿主菌，冰浴条件下加入上述连接产物，冰浴30 min，42℃休克90 s后，迅速冰浴2 min，加LB培养液500 μL，37℃保温1 h，涂于氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃培养过夜。随机挑取上述连接产物转化的单个菌落，扩大培养，用离心柱型普通质粒小提试剂盒提取重组质粒DNA，分别用HINDⅢ、XbaⅠ单酶切载体pL(fluc)SN，酶切产物于0.8%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外透射仪观察结果。将酶切鉴定正确的质粒命名为pL(fluc)SN。

1.2.2 重组pL(fluc)SN载体的包装

活化鉴定正确的重组pL(fluc)SN宿主菌单个菌落，接种于50 mL LB培养液中培养过夜，用上述质粒提取试剂盒提取质粒，溶于无菌Nuclease－Free水200 μL中。加1/10倍体积的3 mol/L乙酸钠，2.5倍体积的无水乙醇，混匀后置于－20℃（＞30 min）后14 000 g离心，弃上清，70%乙醇于超净台内冲洗晾干，溶于无菌Nuclease－Free水50 μL中备转染用。

选择生长状态良好的逆转录病毒的单噬性包装细胞GP+E86，用胰蛋白酶消化后按1×105的细胞数接种于6孔板中，用含10%小牛血清的DMEM培养基培养，置于37℃、5%CO2培养箱培养。当细胞生长达60%～70%融合时可供DNA转染用。将4 μg DNA溶于250 μL无血清培养基中，将10 μL lipofectamine 2000溶于250 μL无血清培养基中，将上述两溶液轻轻混匀，置室温20 min；弃去细胞培养液，用无血清培养基洗涤细胞2次；将lipofectamine 2000－DNA混合物小心滴加到包装细胞上，轻轻混匀，置37℃、5%CO2培养箱培养5 h后弃培养上清，换新鲜含10%小牛血清的DMEM完全培养基，继续培养，每24 h收获瞬时病毒上清，连续3次，于－70℃储存用于感染双噬性逆转录病毒的包装细胞PA317。

选择生长状态良好PA317细胞，用胰蛋白酶消化后以1×105细胞数接种于6孔板中，用含10%小牛血清的DMEM培养基培养，置于37℃、5%CO2培养箱培养至60%～70%融合时用于感染。弃旧培养基，加入24 h收获的Luc单噬性逆转录病毒上清2 mL，并同时加入polybrene 8 μg/mL，2 h后更换新鲜含10%小牛血清的DMEM完全培养基，继续培养。将收获的病毒上清每12 h再感染包装细胞1次，连续3次，再培养24 h，细胞按1∶10～1∶30的比例传代，并用800 μg/mL G418筛选至抗性细胞集落形成，挑选细胞集落扩大培养，以制备含病毒的包装细胞上清并测定病毒滴度。转染的包装细胞命名为PA317/fluc。空白质粒pLXSN包装方法同上，转染的包装细胞命名为PA317/0。收集PA317/fluc细胞培养上清液，4 000 r/min离心10 min，-70℃保存备用。1.2.3重组逆转录病毒滴度测定

将生长状态良好的NIH 3T3细胞用胰蛋白酶消化，按1∶3传代于6孔板中，37℃、5%CO2培养箱培养24 h，当细胞达60%～80%融合时用于病毒滴度测定。将制备的病毒液作10-2、10-3、10-4倍比稀释。吸去6孔板中NIH 3T3细胞的培养液，分别吸取1 mL稀释的病毒液加在NIH 3T3细胞上，并加入polybrene至终浓度8 μg/mL，每个稀释倍数设2个平行孔，37℃、5%CO2培养箱培养2 h，再补加培养液培养24 h，传代NIH 3T3细胞，用含800 μg/mL G418的DMEM培养液培养21 d，计细胞数大于50的抗性集落数，计算平均值。病毒滴度的单位为克隆形成单位（Clone forming units，CFU）/毫升（mL）。空质粒pLXSN的包装及病毒滴度测定完全同上。

病毒滴度=抗性细胞克隆数×病毒稀释倍数÷病毒上清体积

1.2.4 PA317/fluc荧光素酶活性检测

用Bright-GloTMLuciferase Assay System检测荧光素酶活性。提前将5×102～1×106不同数量级个PA317/fluc细胞接种于24孔板，待贴壁完全后吸净细胞培养液，用预冷的PBS洗2次，每孔加入细胞裂解液及无血清的DMEM等比混合液100 μL，晃动数次以保证完全覆盖细胞。吸取细胞裂解液加入到小烧杯中，20 min内用BPCL型微弱发光测量仪检测20 s内的发光值，并用BPCL分析软件计算均值，活性用相对光度单位（RLU）/转染效率表示。

2 结果

2.1 含目的基因的重组质粒连接产物及酶切鉴定

线性化粘平末端的pLXSN载体与fluc基因片段用T4 DNA ligase连接、转化DH 5α感受态宿主菌，经HINDⅢ单酶切和XbaⅠ单酶切后各得到两个片段，与预期大小相近，故而证明重组表达载体构建成功（图2）。

2.2 逆转录病毒包装细胞系的建立及病毒滴度测定

重组pL（fluc）SN载体DNA 4μg经脂质体转染法转染GP+E86后收集病毒上清“乒乓”感染PA317包装细胞（图3A），800 mg/L G418筛选，14 d后挑选抗性细胞集落(图3B)，继续用含800 mg/L G418的完全DMEM培养液中扩大培养，生长至2周左右收集病毒上清用以测病毒滴度。以NIH 3T3为靶细胞测定病毒滴度，21 d后镜下可见抗性细胞集落形成，结晶紫染色并计数。测滴度为2×105pfu/cell。

2.3 PA317/fluc荧光素酶活性检测

PA317/fluc荧光素酶活性检测示，G418抗性包装细胞表达荧光素酶，且酶活性随细胞数目的增多而增加，两者呈相关关系，最小检测细胞数为500个（图4）。

图3 逆转录病毒包装细胞

图4 PA317/fluc荧光素酶活性与细胞数的关系

3 讨论

生物发光活体成像技术的原理是将fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素（Luciferin），即可在数分钟内产生发光现象。这种酶在ATP及氧气存在的条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，故仅在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关，因而可用于细胞及基因的活体内示踪。本研究成功构建了逆转录病毒-荧光素酶报告基因表达载体，并检测了包装细胞荧光素酶表达活性，证实我们构建的载体携带有fluc目的基因，为进一步用此报告基因标志干细胞、研究干细胞移植后的体内生物学行为奠定了基础。

目前，临床约85%的基因治疗项目采用病毒载体。逆转录病毒载体具有将外源基因稳定整合进入靶细胞的基因组中且感染效率高的优点，故能够实现目的基因的长期、稳定、高效表达。此外，逆转录病毒载体还有宿主细胞范围广、制备方便等优点，最适于体外间接基因治疗。在本实验中，我们采用的逆转录病毒载体pLXSN，可以高效率地感染啮齿类和灵长类细胞。该载体含有从鼠源病毒（MoMuLV和MoMuSV）的长末端重复序列（LTR）。一旦转染入包装细胞系，pLXSN能够整合到细胞基因组中，并稳定表达一个病毒包装信号(Ψ),一个用于在真核细胞中G418抗生素筛选的新霉素抗性基因（Neo）和直接位于病毒的即早启动子（PCMV）下游的靶基因序列。以载体为模版的转录体可被在包装细胞中表达的逆转录病毒外壳蛋白包装，从而形成有感染力却复制缺陷型的逆转录病毒颗粒[5-6]。

逆转录病毒介导的基因转染所面临的最大难题在于病毒滴度较低，影响了外源基因的转染效率。我们将构建的pL(fluc)SN导入GP+E86单嗜性细胞并获得瞬间表达，继而再感染PA317双嗜性细胞，即所谓“乒乓效应”(Ping-pong mechanism)，获得高滴度重组病毒，为提高逆转录病毒fluc基因感染效率奠定了基础。

本实验中，我们将fluc基因亚克隆至逆转录病毒表达载体pLXSN，成功构建了pL(fluc)SN载体，用脂质体转染法“乒乓”转染GP+E86和PA317包装细胞，G418筛选，直至出现抗性克隆，扩大培养，测定病毒滴度，并检测荧光素酶活性，为进一步研究活体动物体内光学成像奠定了良好的实验基础。

[1]张怡,韩彧,赵春林.活体动物体内光学成像技术的研究进展[J].生命科学,2006(18):25-30.

[2]Troy T,Jekic-McMullen D,Sambucetti L,et al.Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminscent reporters in animal models[J].Mol Imaging,2004, 3(1):9-23.

[3]王恒湘,郭子宽.间充质干细胞在组织再生应用中的诸多问题[J].组织工程与重建外科,2008,4(5):241-245.

[4]Cao YA,Wagers AJ,Beilhack A,et al.Shifting foci of hematopoiesis during reconstitution from single stem cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(1):221-226.

[5]Cornetta K.Regulatory issues in human gene therapy[J].Blood Cells Mol Dis,2003,31:51-56.

[6]Armbruester V,Sauter M,Roemer K,et al.Np9 protein of human endogenous retrovirus K interacts with ligand of numb protein X [J].J Virol,2004,78:10310-10319.

Construction of Recombinant Retroviral Vector Containing Firefly Luciferase Reporter Gene

BIAN Suyan1,GAI Luyue1,YE Ping1,YANG Yuefeng2,WANG Rongliang2,WANG Hua2,GUO Zikuan2,Wang Lisheng2.
1 Second Department of Cardiology,Southern building,General Hospital of PLA,Beijing 100853,China.2 Department of Experimental hematology,Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China.Corresponding author:GAI Luyue.

ObjectiveTo construct recombinant retroviral vector carrying firefly luciferase reporter gene(fluc)for further study of bioluminescence imaging in vivo.MethodsTarget gene-fluc was obtained by cutting firefly luciferase reporter gene(fluc)vector pGL3-Basic using restriction enzyme digestion.Then fluc gene was sub-cloned into retroviral vector pLXSN.GP+E86 and PA317 pakage cells were infected by the obtained recombinant retroviral vector pL(fluc)SN with ping-pong infection assay and screened with G418 resistance.The stable expression of the fluc gene in positive clones was identified by detecting luciferase enzyme activity.ResultsEnzyme digestion indicated that the retroviral vector pL(fluc)SN was successfully constructed.The fluc gene was integrated into the PA317 and GP+E86 genome and expressed stably in the host cells.ConclusionThe target retroviral vector pL(fluc)SN was constructed successfully.It provides an effective tool or platform for basic research of tracing grafted cells.

Firefly luciferase reporter gene(fluc)vector,pGL3-Basic;Recombinant retroviral vector,pLXSN; Construction

Q784

A

1673－0364（2009）－02－0075－04

2009年1月16日；

2009年2月23日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.04.004

自然科学基金青年基金面上项目（30400182）；国家高技术发展计划（863）项目（2007AA02Z454）。

100853北京市解放军总医院心血管二科（边素艳，盖鲁粤，叶平）；100850北京市军事医学科学院放射医学研究所实验血液学研究室（杨月峰，王荣亮，王华，郭子宽，王立生）。

盖鲁粤。