阿拉伯糖-豌豆肽美拉德反应中间体的抗氧化性研究

摘 要：本文研究阿拉伯糖-豌豆肽美拉德反应中间体的抗氧化活性，并与豌豆分离蛋白酶解液以及豌豆肽完全美拉德反应产物进行比较。结果表明，豌豆肽中间体的DPPH自由基清除活性、还原力和Fe2+螯合能力均高于酶解液。中间体的DPPH自由基清除活性比完全美拉德反应产物低，还原力接近完全美拉德反应产物，Fe2+螯合能力比完全美拉德反应产物强，浓度为6.0 mg·mL-1时，中间体的Fe2+螯合率达到96.64%。说明阿拉伯糖-豌豆肽美拉德反应中间体可作为一种新型抗氧化剂应用于食品中。

关键词：豌豆肽；美拉德反应中间体；抗氧化

Study on the Antioxidant Activity of Aarabinose-Pea Peptides Maillard Reaction Intermediates

ZHOU Xue， FANG Xin， LIU Yuan， WAN Suqin， CHEN Hong*

（Jiangsu Institute for Food and Drug Control， Nanjing 210008， China）

Abstract： In this paper， the antioxidant activity of arabinose-pea peptide Maillard reaction intermediates was studied， and compared with pea isolate protein hydrolysate and pea peptide complete Maillard reaction products. The results showed that the DPPH radical scavenging activity， reducing power and Fe2+ chelating ability of pea peptide intermediates were higher than those of the enzymatic hydrolysate. The DPPH radical scavenging activity of the intermediate was lower than that of the complete Maillard reaction product， the reducing power was close to that of the complete Maillard reaction product， and the Fe2+ chelating ability was stronger than that of the complete Maillard reaction product， and the Fe2+ chelating rate of the intermediate reached 96.64% at a concentration of 6.0 mg·mL-1. These results indicated that arabinose-pea peptide Maillard reaction intermediate can be used as a new antioxidant in food.

Keywords： pea-peptides; Maillard reaction intermediates; antioxidation

对于含脂类的食品，特别是含有不饱和脂肪酸的，易发生氧化反应，产生不良风味且会缩短食品的保质期。目前在食品中经常使用人工合成抗氧化剂来抑制脂类的氧化，防止食品变质。但人工合成抗氧化剂的安全性受到了质疑，因此有必要寻求一种新型抗氧化剂。

美拉德反应可划分为3个发展阶段，包括起始发展阶段、第二发展阶段和最后发展阶段[1]。起始发展阶段的主要反应是氨基与还原糖的羰基发生缩合反

应，醛糖经Amadori重排生成Amadori重排产物（Amadori Rearrangement Products，ARPs）；酮糖则经Heyns重排生成Heyns重排产物，将美拉德反应起始发展阶段的产物统称为美拉德反应中间体。美拉德反应中间体已被报道发挥着重要的抗氧化作用[2]。ARPs能够清除自由基的原因是自由基电子能够与醛糖残基上的羰基或与羰基相邻的羟基碳形成分子内氢键[3]，产生稳定的自由基中间体，从而导致自由基链式反应被打断，氧化反应被遏止。豌豆分离蛋白作为一种低过敏性的植物蛋白，深受消费者青睐，通过酶解和后续的美拉德反应，既可以提高蛋白利用率，又可以改善酶解液的苦味。因此，进一步系统研究豌豆肽美拉德反应中间体抗氧化性能可拓宽其在食品中的应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

蛋白含量约为85%的豌豆蛋白，山东烟台东方蛋白科技有限公司；复合蛋白酶、氨肽酶，安徽强旺调味食品有限公司；铁氰化钾、氯化铁、菲咯嗪、氯化亚铁、2，2-联苯基-1-苦基肼基等，分析纯，Sigma-Aldrich试剂（中国）有限公司（上海）；D-阿拉伯糖，食品级，上海源叶生物科技有限

公司。

电子天平、pH计，METTLER TOLEDO公司；高速冷冻离心机，EPPENDORF公司；A360型紫外可见分光光度计，翱艺仪器（上海）有限公司；数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 豌豆分离蛋白酶解液的制备

配制10%（质量分数）的豌豆分离蛋白水溶液，100 ℃热变性30 min，冷却至室温。调节pH值为8.0左右，同时将温度调整为（60±2）℃，然后添加复合蛋白酶（3 500 U·g-1底物），酶解4 h，调节温度至（50±2）℃，并添加氨肽酶（400 U·g-1底物），酶解4 h。酶解结束后，100 ℃加热10 min以达到灭酶的目的，降低温度为22 ℃左右，离心后取上清液备用。

1.2.2 豌豆肽美拉德反应中间体的制备

将豌豆蛋白酶解液和阿拉伯糖按20∶3的质量比混合均匀，用6 mol·L-1 NaOH调节pH值至7.5，80 ℃反应60 min，反应结束后立即用冰水浴终止反应，所得产物即为美拉德反应中间体（MRIs）[4]。

1.2.3 豌豆肽完全美拉德反应产物的制备

参照1.2.2项方法配制反应液，用6 mol·L-1 NaOH调节pH值至7.5，120 ℃反应120 min，反应结束后立即用冰水浴终止美拉德反应，所得产物即为完全美拉德反应产物（MRPs）。

1.2.4 抗氧化能力的测定

（1）DPPH自由基清除能力测定。在试管中加入1 mL样品溶液、3 mL 0.1 mmol·L-1的DPPH乙醇溶液，涡旋1 min，22 ℃暗光放置30 min，离心取上清液，测定其在517 nm的吸光值。用浓度为95%的乙醇溶液替代DPPH乙醇作为对照。按公式（1）计算DPPH自由基清除率。

（1）

式中：Ay为试验品吸光值；Ad为对照品吸光值；Ab为空白吸光值（用去离子水代替样品溶液）。

（2）还原力测定。添加1 mL的样品、2.5 mL pH值为6.6的磷酸盐缓冲液和2.5 mL 1%K3[Fe（CN）6]溶液于试管中，涡旋1 min。（50±2）℃加热20 min，降低温度至室温，继续添加2.5 mL 10%的三氯乙酸，离心。取2.5 mL上清液，并加入2.5 mL去离子水和

2.5 mL 0.1%FeCl3溶液混匀。等待10 min并测定溶液在700 nm处的吸光值A700。

（3）螯合Fe2+能力的测定。在试管中加入1 mL样品溶液、1.85 mL去离子水和0.05 mL 2 mmol·L-1 FeCl2溶液，混合均匀，室温下放置30 s，再吸取

0.1 mL菲咯嗪溶液（浓度5 mmol·L-1）于试管中，

22 ℃反应10 min。将去离子水作为空白对照，测定溶液在562 nm处的吸光值。螯合率计算公式为

（2）

式中：A0为空白的吸光度；A1为样品的吸光度。

1.2.5 数据分析

使用Microsoft Excel 2019（Microsoft，Redmond，

WA，USA）制表和画图。所有试验至少重复3次，实验结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基清除能力

由图1可知，在浓度为0.1～1.0 mg·mL-1时，MRPs的DPPH自由基清除率较高，且在0.9 mg·mL-1时，其清除率分别是中间体（MRIs）和酶解液的

1.53倍和8.65倍。这可能是因为类黑素具有高DPPH自由基清除能力，随着美拉德反应程度的加深，MRPs中类黑素的含量最高，因此MRPs的DPPH自由基清除能力最强[5]。中间体的DPPH自由基清除率一直高于酶解液的DPPH自由基清除率，这是因为中间体不仅含有ARPs，还含有肽，二者均可以提供氢原子，促进稳定的非自由基形式DPPH-H的生成[3]，而酶解液中仅有肽能提供氢原子。

2.2 还原力

由图2可知，在浓度为0.5～3.0 mg·mL-1时，酶解液的还原力最弱且几乎没有变化，当浓度为

3.0 mg·mL-1时，中间体（MRIs）和MRPs的还原力约为酶解液的4.4倍，说明通过与阿拉伯糖的美拉德反应可以增强酶解液的还原力。在该浓度范围内，中间体和MRPs的还原力与其浓度呈线性正相关，且线性系数R2均大于0.99，说明两者的还原力基本上相当。这可能是因为中间体中的ARPs能提供电子[3]，而MRPs中棕色化合物的羟基和吡咯基团也可以提供电子，均能将铁离子还原为亚铁离子[6]。

图1 酶解液、MRIs、MRPs的DPPH自由基清除率

图2 酶解液、MRIs、MRPs的还原力

2.3 Fe2+螯合能力

由图3可知，在1.0～10.0 mg·mL-1的浓度水平下，酶解液的Fe2+螯合能力没有明显增强；中间体（MRIs）和MRPs在1.0～6.0 mg·mL-1浓度水平下的Fe2+螯合能力随浓度增加而增强，之后趋于稳定。3种样品的Fe2+螯合能力从强到弱依次为中间体、酶解液、MRPs，且当浓度达到6.0 mg·mL-1时，中间体的Fe2+螯合率达到96.64%。MRPs的Fe2+螯合能力可能归因于其中的羟基或吡咯基团以及类黑素，类黑素作为阴离子亲水聚合物，可以与金属阳离子结合形成稳定的配合物。豌豆分离蛋白酶解液中含有的大量小肽，肽序列中的谷氨酸、赖氨酸和精氨酸等有助于提高Fe2+的螯合活性，因此酶解液的Fe2+螯合能力较强。中间体的Fe2+螯合能力不仅与含有上述可提高Fe2+螯合活性的氨基酸有关，而且与Fe2+也能够与ARPs中的这些氨基酸片段结合，同时还可以与ARPs中的阿拉伯糖片段上的羰基氧配位有关，因此其Fe2+的螯合能力最强。

3 结论

本文选择DPPH自由基清除率、还原力和螯合Fe2+能力3个指标评判豌豆肽美拉德反应中间体的抗氧化作用，结果发现阿拉伯糖-豌豆肽美拉德反应中间体的DPPH自由基清除活性、还原力和Fe2+螯合能力都高于豌豆蛋白酶解液，说明通过美拉德反应，物质的抗氧化活性得到了提高。总之，豌豆肽美拉德反应中间体具有一定的抗氧化能力，可作为一种抗氧化剂在食品生产中应用。

参考文献

[1]HODGE J E.Dehydrated foods，chemistry of browning reactions in model systems[J].Journal of Agricultural amp; Food Chemistry，1953，1（15）：625-651.

[2]卢思芸.肽美拉德反应中间体形成示踪机制和水相制备[D].无锡：江南大学，2020.

[3]崔和平.美拉德反应中间体的水相制备及其加工风味形成规律研究[D].无锡：江南大学，2019.

[4]周雪.减盐增鲜豌豆肽美拉德中间体制备及加工风味受控形成[D].无锡：江南大学，2021.

[5]刘晓丹，肖瀛，吴金鸿，等.加热对美拉德反应产物主要成分及其抗氧化活性的影响[J].粮食与油脂，2024，37（3）：139-143.

[6]GU F L，KIM J M，ABBAS S，et al.Structure and antioxidant activity of high molecular weight Maillard reaction products from casein-glucose[J].Food Chemistry，2010，120（2）：505-511.