CRISPR-Cas技术在食品微生物检验中的应用

摘 要：食品安全检测是保障公众健康的重要环节。CRISPR-Cas技术作为一种新型的基因编辑工具，在食品微生物检验领域展现出广阔的应用前景。本文系统综述了CRISPR-Cas技术的基本原理及其在乳制品、肉类、水产品和果蔬等不同食品微生物检验中的应用，为进一步推动CRISPR-Cas技术在食品安全领域的应用提供参考。

关键词：CRISPR-Cas技术；食品安全；微生物检验

Application of CRISPR-Cas Technology in Food Microbiological Inspection

FENG Xue

（Tangshan Food and Drug Comprehensive Inspection and Testing Center， Tangshan 063000， China）

Abstract： Food safety testing is an important link to protect public health. CRISPR-Cas technology， as a new gene editing tool， has shown broad application prospects in the field of food microbiological testing. In this paper， the basic principle of CRISPR-Cas technology and its application in microbial inspection of different foods such as dairy products， meat， aquatic products and fruits and vegetables were systematically reviewed， so as to provide references for further promoting the application of CRISPR-Cas technology in the field of food safety.

Keywords： CRISPR-Cas technology; food safety; microbial testing

食品安全是关系国计民生的重大问题，其中食源性病原菌污染一直是食品安全领域的重点关注对象[1]。随着社会的快速发展和人们生活水平的不断提高，人们对食品安全和质量的要求越来越高。因此，建立快速、灵敏、特异性强的食品微生物检测方法对于保障食品安全、维护公众健康具有重要意义。近年来，基因编辑技术CRISPR-Cas因其操作简单、特异性强、检测速度快等优势而受到广泛关注。本文将重点介绍CRISPR-Cas技术的基本原理，综述CRISPR-Cas技术在不同食品（如乳制品、肉类、水产品和果蔬等）微生物检验中的应用，为进一步推动CRISPR-Cas技术在食品安全领域的应用提供参考。

1 食品微生物检验现状

食品微生物检验是食品安全控制体系中不可或缺的重要环节，其目的是及时准确地检测出食品中潜在的微生物危害，为食品安全风险评估和控制提供科学依据。目前，食品微生物检验主要采用传统的培养法和现代分子生物学技术。传统的培养法包括平板计数法、最大似然数法等。其原理是将食品样品在选择性或差异性培养基上进行培养，根据菌落形态、颜色等特征进行初步鉴定，再结合生化实验确定微生物种类。尽管培养法操作简单，但存在检测周期长（一般需要2～7 d）、无法检出难以培养或处于应激状态的微生物等问题。随着分子生物学技术的发展，核酸扩增技术如聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）、核酸杂交等在食品微生物检验中得到广泛应用。PCR技术通过特异性引物扩增微生物基因组的特定片段，再通过琼脂糖凝胶电泳或实时荧光定量的方法进行产物分析，可在数小时内对目标微生物进行定性或定量检测，大大缩短了检测周期。但PCR技术对反应条件要求较高，易受到食品基质中杂质的干扰，且无法区分活菌和死菌。此外，核酸杂交技术利用DNA分子间的互补配对原理，通过探针与靶标杂交实现微生物的快速检测，但操作较为烦琐，灵敏度和特异性也有待进一步提高。因此，迫切需要开发新的食品微生物快速检测技术，CRISPR-Cas技术有望在该领域发挥重要作用。

2 CRISPR-Cas技术原理与特点

CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌中广泛存在的一种获得性免疫系统，可以特异性识别并切割外源DNA，从而抵御病毒或质粒等遗传元件的侵染[2]。CRISPR-Cas系统由CRISPR基因座和Cas蛋白构成。CRISPR基因座包含一系列重复序列和间隔序列，其中间隔序列来源于外源DNA片段，作为病毒或质粒入侵的“分子记忆”。Cas蛋白是一类RNA介导的核酸酶，根据序列和结构的差异可分为多个家族和型别。在CRISPR-Cas系统介导的适应性免疫过程中，外源DNA首先被Cas蛋白处理成短小片段并整合到CRISPR基因座的间隔区，形成新的间隔序列。当再次受到同源病毒或质粒入侵时，间隔序列被转录成前crRNA，并在Cas蛋白的作用下成熟为crRNA。成熟的crRNA与Cas蛋白形成效应复合物，crRNA的间隔序列与入侵的外源DNA互补配对，引导Cas蛋白特异性切割靶标DNA，从而抵御外源遗传元件的侵染。根据CRISPR-Cas系统的基本原理，研究者发展了多种基于CRISPR-Cas的核酸检测技术，其中最具代表性的是CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a介导的DNA检测，以及CRISPR/Cas13a介导的RNA检测[3]。

与传统核酸扩增技术相比，CRISPR-Cas技术具有显著优势。①由于Cas蛋白具有极高的特异性，可以实现单碱基差异的区分，因此该方法的特异性较强。②CRISPR-Cas技术可以在恒温条件下快速检测，操作简便、快速。③CRISPR-Cas技术的灵敏度较高，远高于PCR法等传统方法。④通过设计多重sgRNA，可实现对多种核酸靶标的同时检测。⑤Cas蛋白切割可以产生多种可检测信号，如荧光、比色、电化学等，适用于不同的检测平台。

3 CRISPR-Cas技术在不同食品微生物检验中的应用

3.1 乳制品微生物检验

乳制品是最易受到微生物污染的食品之一，其中以李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌等食源性致病菌危害最为严重，因此建立高效、快速的乳制品微生物检测方法对于保障乳品质量安全至关重要。近年来，多项研究成功将CRISPR-Cas技术应用于乳制品中重要致病菌的特异性检测。狄慧玲[4]建立了基于CRISPR/Cas系统的单核细胞增生李斯特菌快速检测方法。结果表明，该系统可有效评估不同种类食品中单核细胞增生李斯特菌的流行现状，同时通过研究该菌不同毒力株中CRISPR/Cas系统的存在形式及保护范围，可用于预防和控制由该菌引发的食品安全风险。段宁慧[5]利用基于G四面体的CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌。结果表明，基于G四面体的CRISPR-Cas12a系统不仅充分利用了基于CRISPR-Cas12a系统诊断的高灵敏度和高特异性，还将目标识别转化为可视化的信号读数，拓宽了应用范围。

3.2 生鲜肉类微生物检验

生鲜肉类是食源性致病菌的主要载体之一，尤其是禽畜产品中常见的沙门氏菌、弯曲菌和大肠杆菌O157：H7等，这些致病菌不仅会引起腹泻、呕吐等胃肠道症状，还可能诱发败血症、肾衰竭等严重并发症，因此对生鲜肉类进行微生物检验对于预防食品安全事故至关重要。近年来，CRISPR-Cas技术凭借其高特异性、灵敏度和通量的优势在生鲜肉类微生物检验领域得到了广泛应用。WANG等[6]建立了基于CRISPR/Cas12a的猪肉中沙门氏菌的快速检测方法。结果表明，以invA基因为靶标设计的crRNA引导Cas12a切割靶标DNA后可激活对单链荧光报告探针的非特异性切割，产生可检测的荧光信号，检测时间为30 min，灵敏度达到101 CFU·g-1，与传统的PCR方法相当。

3.3 水产品微生物检验

水产品是人们日常饮食中不可或缺的重要组成部分，然而由于水环境复杂多变，加之渔业养殖、贮运和加工等环节容易引入微生物污染，因此水产品极易成为副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌等水源性致病菌的传播介质，严重威胁消费者的身体健康。传统的水产品微生物检验方法如平板计数法和PCR技术，存在检测周期长、特异性差等缺点，难以满足水产品安全监管的需求。近年来，CRISPR-Cas技术以其操作简便、灵敏度高、特异性强等优势，在水产品微生物检验领域得到了广泛关注。LV等[7]建立了用于检测虾样品中的副溶血性弧菌的CRISPR/Cas12a-RAA的单管新型检测系统。结果表明，该方法在纯培养物和虾样品中的检测限分别为67 CFU·mL-1和73 CFU·mL-1，具有更高的灵敏度和特异性。

3.4 生鲜果蔬微生物检验

生鲜果蔬是人们日常饮食中必不可少的营养来源，然而其生长环境复杂，采收和运输过程不当极易造成微生物污染，尤其是大肠杆菌O157：H7、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌等食源性致病菌，已成为导致果蔬相关疾病暴发的主要原因。传统的果蔬微生物检测主要依赖于细菌分离培养和血清学鉴定，存在检测周期长、灵敏度低等不足，难以满足生鲜果蔬快速检测的需求。近年来，CRISPR-Cas技术凭借其操作简单、特异性强和通量高的优势，为生鲜果蔬中致病菌的快速、灵敏检测提供了新的思路。LUO等[8]建立了用于水果中沙门氏菌现场快速检测的CRISPR/Cas12a的可视化微流控芯片。结果表明，该系统利用Cas12a的特异性切割双链DNA和非特异性单链DNA转切能力，为分子诊断提供了有效的信号放大工具。

3.5 豆类微生物检验

豆类作为主要的农作物和重要食品原料，其微生物污染问题一直是食品安全领域的关注重点。豆类极易受到黄曲霉菌、葡萄球菌和大肠杆菌等有害微生物的侵染，产生有毒有害物质，威胁消费者健康。传统的豆类微生物检验方法主要依赖于细菌分离培养和生化鉴定，存在检测周期长、灵敏度低等不足。近年来，CRISPR-Cas技术以其高特异性、高灵敏度和高通量的优势，为谷物和豆类中致病菌的快速检测提供了新的途径。例如，WU[9]提出了一种基于CRISPR/Cas12a切割G-四链体DNAzyme的多模态生物传感器，用于检测黄曲霉毒素B1。该方法通过黄曲霉毒素B1与适配体的特异性结合激活Cas12a，切割G4-DNAzyme，形成着色/SERS/荧光信号增强的TMBox，用于视觉检测。结果表明，该方法在花生、玉米和巴丹样品中具有良好的检测性能，并成功应用于被黄曲霉毒素B1自然污染的花生样品检测，验证了其在实际应用中的可行性。总之，CRISPR-Cas技术凭借其独特的优势，为豆类微生物检验领域带来了革命性的变革，有望全面提升谷物和豆类食品安全保障水平。

4 结语

CRISPR-Cas技术凭借其高特异性、快速便捷和灵敏度高等优势，在食品微生物检验领域具有巨大的应用潜力。目前，该技术已成功应用于乳制品、肉类、水产品和果蔬等多种食品中重要致病菌的检测，显著提高了食品安全检测的效率和准确性。未来，随着CRISPR-Cas技术的不断优化和检测平台的进一步发展，有望实现更高灵敏度、更低成本和更高通量的食品微生物检测。特别是CRISPR-Cas技术与微流控、生物传感等新兴技术的结合，将为食品安全快速检测提供更多技术支持，推动食品安全监管体系的完善和发展。

参考文献

[1]周洁，黄夏宁，林洁，等.CRISPR-Cas技术在病原微生物检测中的研究进展[J].中国口岸科学技术，2024，6（增刊1）：4-10.

[2]彭磊.基于CRISPR-Cas12a平台检测金黄色葡萄球菌[D].天津：天津科技大学，2021.

[3]冀霞，代绍密，余若菁，等.CRISPR-Cas12a检测牛奶中大肠杆菌方法的建立与评价[J].食品研究与开发，2023，44（18）：179-184.

[4]狄慧玲.单核细胞增生李斯特菌分子分型研究及CRISPR/Cas系统解析[D].广州：华南理工大学，2014.

[5]段宁慧.基于CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌[D].天津：天津科技大学，2022.

[6]WANG B，WANG H，LU X B，et al.Recent advances in electrochemical biosensors for the detection of foodborne pathogens： current perspective and challenges[J].Foods，2023，12（14）：2795.

[7]LV X R，CAO W W，ZHANG H，et al.CE-RAA-CRISPR assay： a rapid and sensitive method for detecting vibrio parahaemolyticus in seafood[J].Foods，2022，11（12）：13.

[8]LUO Y N，SHAN S，WANG S L，et al.Accurate detection of Salmonella based on microfluidic chip to avoid aerosol contamination[J].Foods，2022，11（23）：3887.

[9]WU Z H，SUN D W，PU H B.CRISPR/Cas12a and G-quadruplex DNAzyme-driven multimodal biosensor for visual detection of Aflatoxin B1[J].Spectrochimica Acta Part A： Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2023，302：123121.