分子生物学技术在沙门氏菌检测中的应用

摘 要：沙门氏菌是一种常见的人畜共患食源性病原体，对公众健康构成严重威胁，影响了食品行业的健康发展，已成为全球关注的焦点之一。本文综述分子生物学在沙门氏菌检测中的应用，以期为政府监管部门及第三方检测机构的研究提供参考。

关键词：沙门氏菌；分子生物学检测技术；应用

Application of Molecular Biology Techniques in Salmonella Detection

ZHAI Pingping， ZHU Yingfei*， FAN Hongwei， ZHAN Zhongxu， XIONG Lixia

（Jiangxi Provincial Institute of Inspection， Testing and Certification Food Inspection and Testing Institute，

Nanchang 330000， China）

Abstract： Salmonella is a common zoonotic food-borne pathogen， which poses a serious threat to public health and affects the healthy development of the food industry， and has become one of the focus of global concern. In this paper， the application of molecular biology in Salmonella detection is reviewed in order to provide reference for the research of government supervision departments and third party detection institutions.

Keywords： Salmonella; molecular biology techniques; application

沙门氏菌是一种主要的食源性病原体，可导致严重的人类和动物疾病，具有较高的发病率和死亡率[1-2]。由于传统的沙门氏菌检测方法费时费力，因此快速、准确的检测技术对食品安全和诊断该类食源性疾病至关重要。常规的沙门氏菌检测步骤包括细菌分离、生化鉴定和血清学确证试验等[3]。虽然该方法可靠，但耗时（需要5～7 d）。此外，不同细菌之间可能发生生化交叉反应[4]。近年来基于核酸分子检验技术的发展速度较快，此类技术具有敏感、特异、快速和简单等优势。随着时代的进步，该技术在我国检验检疫领域的应用也不断扩大。我国要求市级以上疾病预防控制中心具有核酸分子检测技术的能力，旨在有效监管食品安全[5]。目前，各种基于分子生物学方法，如PCR、qPCR、数字PCR以及等温扩增等，具有快速性、特异性和敏感性，已成功用于食品中沙门氏菌的检测。

1 常规PCR检测技术

常规PCR检测技术因不涉及样品的预富集或样品处理，具有简单、高效（耗时3～4 h）和高灵敏度（5～10 CFU·mL-1）的特点[6]。AHMED等[7]使用常规培养法和PCR检测技术鉴定牛肉和鸡肉等食品样本中的沙门氏菌，其中常规培养法需要花费7 d时间，样本检出率为21.3%，而PCR检测技术显示在收到样本后到检测完成在12 h内，检出率为23.3%。相比传统培养法，常规PCR检测技术在沙门氏菌检测中的耗时更短、检出率更高，已被广泛用于食源性病原体检测。

2 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术（Quantitative Real-time PCR，qPCR）已成为一种通用方法[8-9]。XIONG等[10]开发并验证了快速双重实时聚合酶链反应，用于准确识别和定量检测肠炎沙门氏菌，熔解曲线和凝胶电泳分析结果表明，所设计的引物对lygD和invA的扩增具有很强的特异性，双重实时PCR从40种沙门氏菌菌株（包含29种沙门血清型）和12种非沙门氏菌菌株中鉴定出肠炎沙门氏菌，每次反应能检测到4个肠炎沙门氏菌DNA拷贝，与传统培养方法相比，预富集6 h后，该检测方法可从鸡蛋样品中鉴定出肠炎沙门氏菌和沙门氏菌属分离株，且灵敏度更高。qPCR技术由于能够检测非常低浓度的目标样品，且检测速度快，灵敏度高，已被广泛应用于各种病原体的检测中。

3 数字PCR技术

数字PCR（Digital PCR，dPCR）技术是一种新的核酸扩增方法，能够对不同的污染样本进行非常低的浓度定量[11]。FANG等[12]成功开发了一种新型三重液滴数字PCR技术，用于同时鉴定和绝对定量沙门氏菌及其两种重要血清型（肠炎菌和伤寒菌）。该方法的检测限分别低至5 fg·μL-1 gDNA和

10 CFU·mL-1纯培养物。此外，与qPCR相比，三重液滴数字PCR技术用于检测人为污染的食品样品时，检测限较低，为10～102 CFU·mL-1。与qPCR相比，三重液滴数字PCR技术具有高度特异性、灵敏性和绝对定量能力，检验结果更灵敏[13]，适用于样本中低浓度的沙门氏菌检测。

4 等温扩增技术

4.1 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术是最具创新性的分子技术之一，主要用于诊断包括沙门氏菌在内的多种病原体[14]，具有良好的特异性和灵敏度[15]。DOMESLE等[16]利用环介导等温扩增技术-比浊法和荧光法分别检测了300种测试菌株，包括247种沙门氏菌（包含185个血清型）和53种非沙门氏菌。结果表明，两种检验方法具有100%的特异性，不同血清型的

6种沙门氏菌菌株的检测限范围为1.3～28个细胞。在检测动物食品中低浓度水平的沙门氏菌时，环介导等温扩增技术比荧光技术更敏感，并且可以提前

3 d获得结果。环介导等温扩增技术的检测速度更快，灵敏度更高，已成为沙门氏菌筛查的快速、可靠和稳健的方法。

4.2 重组酶聚合酶扩增技术

重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技术具有灵敏度高、成本低的特点，被广泛应用于沙门氏菌的日常检验中。LI等[17]建立了检测沙门氏菌的比色重组酶聚合酶扩增方法，通过对沙门氏菌的invA基因设计RPA引物，等温扩增产生双链DNA扩增子，并通过光敏比色测定直接定量。结果表明，该方法的最低可检测浓度为

5×103 CFU·mL-1，可以快速且低成本地检测沙门氏菌。

4.3 滚环扩增技术

滚环扩增（Rolling Circle Amplification，RCA）技术作为一种新型的核酸等温扩增技术，近年来在沙门氏菌检验中得到广泛应用[18]，具有特异性强、灵敏度高、可测序分析验证结果等优点[19]。WANG等[20]建立了一种基于跳跃式滚环扩增结合光敏比色测定食品中沙门氏菌的新方法。结果表明，该方法的检出限低至13 CFU·mL-1，可快速、灵敏地检测食品中的沙门氏菌。此外，该方法无须昂贵的仪器，可以用于其他食源性病原体或其他含有核酸的生物样本的即时检测。

4.4 聚合酶螺旋反应技术

聚合酶螺旋反应（Polymerase Spiral Reaction，PSR）技术在沙门氏菌检测中具有较高的灵敏度和特异性。XU等[21]建立了一种针对沙门氏菌保守入侵基因的聚合酶螺旋反应检测技术。结果表明，环介导等温扩增技术的检测限为50 CFU·mL-1，具有简单、灵敏、快速的特点，为食源性疾病的预防和检测提供了参考。

4.5 解旋酶依赖性扩增技术

解旋酶依赖性扩增技术，作为一种灵敏度高、特异性强、快速高效、便捷精准的核酸等温扩增技术，在病原体检测研究中得到广泛应用[22]。DU等[23]开发了一种快速、简单、便携的沙门氏菌检测方法，即将嗜热解旋酶依赖扩增与横向流动分析相结合，可在90 min内进行视觉信号检测。结果表明，该方法对DNA和纯培养细菌的检出限分别为73.4～80.7 fg

和35～40 CFU。特异性分析显示，沙门氏菌与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌、产气肠杆菌、志贺氏菌和空肠弯曲杆菌无交叉反应。该方法可用于食品样品中沙门氏菌的快速检测，适用于设备有限的地区。

5 PMA-PCR检测技术

PCR技术无法区分来自非存活细胞和存活细胞的DNA扩增，食品样品中死亡或受损细胞泄漏的大量DNA也可能被扩增，导致出现活细胞数量的高估和潜在的假阳性检测结果的情况[24]。PMA-PCR检测技术只扩增活细胞中目标基因，死亡或受损的细胞中的基因扩增则被抑制，很好地解决了这一难题。HUANG等[25]采用生物信息学方法筛选单增李斯特菌和沙门氏菌高特异性引物，并将其组合构建双qPCR系统，使用单叠氮化丙啶来弥补qPCR无法区分活细胞和非活细胞的缺陷，建立了快速、高特异性、灵敏的AuNPs-SD-PMA-qPCR检测技术。此外，与qPCR系统相比，该技术显著增强了活菌扩增的荧光信号，对乳制品中单增李斯特菌和沙门氏菌富集

6 h后，检测限低至5×101 CFU·g-1。PMA-PCR检测技术可以区分活细胞和死细胞，从而减少了假阳性结果的发生概率。

6 结语

由于影响公共卫生的食源性疾病暴发现象日益增加，对食源性病原体的快速、可靠、敏感和廉价的检测方法的需求增加。PCR、qPCR、dPCR和等温扩增技术等现有的分子检测方法已广泛应用于临床和实验室。此外，分子生物学检测方法也存在一些挑战和局限性，亟待解决。分子生物学检测技术的发展和改进对于食源性病原体的检测更加可靠、灵敏和节省时间，可以提供快速、准确的数据分析结果。

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