乳酸菌发酵牛乳产物中5-羟甲基糠醛含量检测方法的建立及其方法学验证

摘 要：本文建立了一种高效液相色谱法检测乳酸菌发酵牛乳产物中5-羟甲基糠醛含量的方法，并进行了方法学验证。使用Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）进行色谱分离，以0.1%甲酸溶液-乙腈（98∶2，V/V）作为流动相，设置流速为1.0 mL·min-1、进样量为10 μL、柱温为30 ℃以及检测波长为284 nm，外标法定量。结果表明，5-羟甲基糠醛在0.030 2～15.120 0 μg·mL-1线性关系良好，相关系数R2=0.999 9，样品的平均回收率为90.90%。该方法专属性强、稳定性好、耐用性良好，适用于乳酸菌发酵牛乳产物中5-羟甲基糠醛含量的测定。

关键词：乳酸菌发酵；5-羟甲基糠醛；高效液相色谱法；方法学验证

Establishment of a Method for the Detection of 5-Hydroxymethylfurfural Content in Milk Products Fermented by Lactic Acid Bacteria and Its Methodological Validation

ZHONG Dichang， XIONG Yanxia， ZHANG Yang， WU Yuzhen， LI Liying， YU Yinfang*

（Jiangzhong Pharmaceutical Co.， Ltd.， Nanchang 330004， China）

Abstract： A high performance liquid chromatography method for the determination of 5-hydroxymethylfurfural in milk products fermented by lactic acid bacteria was established and the method was verified. The separation was performed on Agilent Zorbax SB-Aq column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） with 0.1% formic acid-acetonitrile （98∶2， V/V） as the mobile phase. The flow rate was 1.0 mL·min-1， the sample size was 10 μL， the column temperature was

30 ℃， and the detection wavelength was 284 nm. The quantification was performed by external standard method. The results showed that 5-hydroxymethylfurfural had a good linear relationship in the range of 0.030 2 μg·mL-1 to

15.120 0 μg·mL-1 with correlation coefficient R2=0.999 9. The average recovery of sample was 90.90%. The method has strong specificity， good stability and good durability， and is suitable for the determination of 5-hydroxymethylfurfural content in milk products fermented by lactic acid bacteria.

Keywords： lactic acid bacteria fermentation; 5-hydroxymethylfurfural; high performance liquid chromatography method; methodological validation

乳酸菌发酵牛乳是乳酸菌发酵食品中使用最广泛的制品之一，牛乳经乳酸菌发酵后可以产生大量的胞外多糖、活性肽、乳酸等乳酸菌代谢产物，可发挥广泛的代谢和调节作用，具有调节肠道菌群、增强机体免疫、缓解非酒精性脂肪肝、抗氧化、降低血脂和胆固醇等生理功能[1-4]。牛乳在乳酸菌发酵以及加工成型过程中，特别是在高温处理时，极易发生美拉德反应，生成一系列的芳香与颜色物质，5-羟甲基糠醛就是其中的代表产物之一[5-7]。相关研究表明[8-10]，5-羟甲基糠醛含量与中药材色泽变化具有一定的相关性。为了进一步表征乳酸菌发酵牛乳产物的外观颜色，为其外观品质鉴别提供量化数据支撑，本研究建立了一种高效液相色谱法检测乳酸菌发酵牛乳产物中5-羟甲基糠醛含量的方法，并进行了方法学考察，以期有效测定乳酸菌发酵牛乳产物中5-羟甲基糠醛的含量，为乳酸菌发酵牛乳产物的质量控制及关键技术指标提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器和试剂

乳酸菌发酵牛乳喷干粉，购于某公司。

ME204 TE电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；1200液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；SB-500DTY超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TD5M台式低速离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；IQ 7000超纯化水仪（厦门精益兴业科技有限公司）。

5-羟甲基糠醛对照品（批号111626，纯度≥99%），中国食品药品检定研究院；甲醇（分析纯），国药化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯），天津市大茂化学试剂厂；甲酸（分析纯），西陇科学股份有限公司；超纯化水。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB -Aq 色谱柱（250 mm×

4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：0.1%甲酸溶液-乙腈（98∶2，V/V）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：284 nm；进样量：10 μL。

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称取5-羟甲基糠醛对照品约3.024 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇，超声使其溶解并定容，得到浓度约为30.24 μg·mL-1的5-羟甲基糠醛对照品储备液。精密吸取储备液2 mL，置于10 mL容量瓶中，用纯化水定容至刻度线，得到浓度约为6.048 μg·mL-1的对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备

精密称取乳酸菌发酵牛乳喷干粉5 g，置于50 mL

容量瓶中，加入纯化水约40 mL，超声10 min使其溶解，放冷，使用纯化水定容至刻度线，摇匀，经

0.45 μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。

1.2.4 专属性

按照1.2.2项的方法制备对照品溶液，1.2.3项的方法制备供试品溶液，精密量取适量对照品溶液、空白溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照1.2.1项下的色谱条件进行检测，记录相应的色谱图。

1.2.5 线性范围

分别取适量1.2.2项下的对照品储备液，配制成浓度分别为0.030 2、0.302 4、0.604 8、1.209 6、

3.024 0、6.048 0 μg·mL-1和15.120 0 μg·mL-1的5-羟甲基糠醛标准系列溶液；依次注入高效液相色谱仪，按照1.2.1项下的色谱条件进行检测，记录色谱图。以5-羟甲基糠醛标准系列溶液的浓度为横坐标，以其对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.6 检出限与定量限

以3倍左右信噪比作为方法的检出限，以10倍左右信噪比作为方法的定量限。在空白溶液中加入已知浓度的5-羟甲基糠醛对照品溶液，经过梯度稀释后，得到不同浓度的样品溶液，依次注入高效液相色谱仪，按照1.2.1项下的色谱条件进行检测。

1.2.7 精密度

精密称取5 g乳酸菌发酵牛乳喷干粉6份，按照1.2.3项的方法制备样品溶液，共6个平行，依次注入高效液相色谱仪，按照1.2.1项下的色谱条件进行检测，记录相应色谱图，计算峰面积。

1.2.8 准确度

精密称取已知5-羟甲基糠醛含量（4.322 8 µg·g-1）的乳酸菌发酵牛乳喷干粉4.0 g各6份，置于50 mL容量瓶中，精密加入对照品储备液20.5 mL，加纯化水约40 mL，超声处理10 min，放冷，使用纯化水定容至刻度线。注入高效液相色谱仪，按照1.2.1项下的色谱条件进行检测，记录相应色谱图，按照峰面积计算5-羟甲基糠醛的含量，计算回收率。

1.2.9 稳定性

按照1.2.3的方法制备供试品溶液，分别在供试品溶液放置0、2、4、6、8、12 h和24 h后，依次注入高效液相色谱仪，按照1.2.1项下的色谱条件进行检测，记录色谱图，计算峰面积。

1.2.10 耐用性

按照1.2.3的方法制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪，分别在流速增减0.1 mL·min-1、柱温增减2 ℃、流动相比例增减1%的色谱条件下进行检测，记录色谱图，计算峰面积。

2 结果与分析

2.1 专属性考察结果

对照品溶液、空白溶液、样品溶液相对应的色谱图见图1。空白溶液在对照品溶液及供试品溶液5-羟甲基糠醛出峰处，没有出现干扰峰，说明该方法专属性较好，没有杂质干扰。

2.2 线性范围考察结果

以5-羟甲基糠醛对照品标准系列溶液的浓度为横坐标，以其对应的峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，其线性关系见图2。线性回归方程为y=

1.351 7x+0.010 2，R2=0.999 9，表明5-羟甲基糠醛浓度在0.030 2～15.120 0 μg·mL-1线性关系良好。

2.3 检出限与定量限

分别以信噪比（S/N）=5和信噪比（S/N）=13.5确定方法的检出限和定量限，计算得到该方法中5-羟甲基糠醛的检出限为0.004 536 μg·mL-1，定量限为0.018 144 μg·mL-1。

2.4 精密度考察结果

精密度考察结果见表1。结果表明，同一浓度下6份供试品峰面积的相对标准偏差为0.09%，表明该方法仪器精密度良好，重复性好，能够满足检测要求。

2.5 准确度考察结果

准确度考察结果见表2。结果表明，6份样品的回收率在89.19%～92.19%，平均回收率为90.90%，相对标准偏差为1.29%，表明该方法回收率稳定、准确度高。

2.6 稳定性考察结果

稳定性考察结果见表3。结果表明，供试品溶液放置0、2、4、6、8、12 h和24 h后，其峰面积的相对标准偏差为1.44%，说明该方法下5-羟甲基糠醛在24 h内稳定性良好。

2.7 耐用性考察结果

耐用性考察结果见表4。结果表明，在流速增减0.1 mL·min-1、柱温增减2 ℃、流动相比例增减1%的色谱条件下，对照品溶液中5-羟甲基糠醛含量的相对标准偏差为0.47%，表明该方法的耐用性良好。

3 结论

本研究建立了一种高效液相液相色谱法测定乳酸菌发酵牛乳喷干粉中5-羟甲基糠醛含量的方法。根据2020年版《中华人民共和国药典》中“9101分析方法验证指导原则”，该方法专属性好，稳定性强，耐用性良好，适用于乳酸菌发酵牛乳产物中5-羟甲基糠醛含量的测定。

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