超高效液相色谱-串联质谱法测定新鲜水果中10种食品添加剂

摘要［目的］建立超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法测定杨梅、桑葚等新鲜水果中多种添加剂的方法。［方法］样品前处理采用乙腈-甲醇-水溶液（V∶V∶V，1∶1∶1）作为提取试剂，经振荡及超声提取后，用纯水稀释及定容，经0.22μm滤膜过滤后，用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法在多反应监测模式（MRM）下分析检测，采用WatersAtlantisT3C18色谱柱（2.1mm×150mm，5μm）作为分析柱，梯度洗脱，外标法定量。［结果］10种添加剂在质量浓度为10.59～3260.67ng/mL线性关系良好（R2≥0.9938），方法检出限为0.02～1.50mg/kg，定量限为0.25～4.00mg/kg；分别向桑葚和杨梅样品中添加浓度为2倍、5倍、10倍定量限浓度的10种添加剂标准品，其平均加标回收率为85.21%～108.92%，RSD为0.74%～9.63%。［结论］建立的方法具有前处理简便、灵敏度高、准确性好、重复性强等优势，能应用于杨梅、桑葚等水果中添加剂的分析检测。

关键词食品添加剂；新鲜水果；超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法

中图分类号TS255.7"文献标识码A"文章编号0517-6611（2025）02-0201-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.02.040

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determinationof10FoodAdditivesinFreshFruitsbyUltraHighPerformanceLiquidChromatography-TandemMassSpectrometry

ZHAOChao-qun，TAORui，ZHAOJing-kaietal

（ZhejiangInstituteforFoodandDrugControl/KeyLaboratoryofStateMarketRegulation（QualityandSafetyofFunctionalFoods）/KeyLaboratoryofZhejiangMarketingBureau（KeyLaboratoryofHealthFoodQualityandSafety），Hangzhou，Zhejiang310052）

Abstract［Objective］Toestablishamethodforthedeterminationofvariousadditivesinfruitssuchaswaxberryandmulberryusingultra-highperformanceliquidchromatographytriplequadrupoletandemmassspectrometry.［Method］Thepre-treatmentofthesamplewascarriedoutusingacetonitrilemethanolwatersolution（V∶V∶V，1∶1∶1）astheextractionreagent.Aftershakingandultrasonicextraction，thesamplewasdilutedandmadetovolumewithpurewater.Using0.22μmfiltermembranefiltersthesamples.Ultra-highperformanceliquidchromatography-triplequadrupoletandemmassspectrometrywasusedforanalysisanddetectionundermulti-reactionmonitoring（MRM）.TheseparationandanalysiswereperformedonaWatersAtlantisT3C18（2.1mm×150mm，5μm），quantitativewithexternalstandardmethod.［Result］Withintherangeof10.59-3260.67ng/mL，thelinearrelationshipof10additiveswasgood（R2≥0.9938），thedetectionlimitofthemethodwas0.02-1.50mg/kg，andthequantitativelimitwas0.25-4.00mg/kg.Theaveragerecoveryratesof10additiveswere85.21%-108.92%between5and10timestheLOQconcentration，andtheRSDwas0.74%-9.63%.［Conclusion］Theestablishedmethodhastheadvantagesofsimplepretreatment，highsensitivity，goodaccuracyandstrongrepeatability，andcanbeappliedtotheanalysisanddetectionofadditivesinfruitssuchaswaxberryandmulberry.

KeywordsFoodadditives;Freshfruits;Ultra-highperformanceliquidchromatography-triplequadrupoletandemmassspectrometry

近年来，为了提升新鲜水果的甜度，同时延长其保质期，市面上一些果农及商家会在水果表面喷洒甜味剂和防腐剂，特别是浆果类水果。食品添加剂在改善食品感官品质、保持营养价值、延长食品货架期、满足加工工艺需求等方面起着非常重要的作用，防腐剂和甜味剂是常用的2类添加剂^［1］。但食品添加剂的安全使用非常重要，特别是化学合成的食品添加剂大都有一定的毒性，要严格控制使用量^［2-3］。我国对在食品中添加甜味剂和防腐剂有严格的限制，常用的甜味剂包括安赛蜜、纽甜、甜菊糖苷、甜蜜素、三氯蔗糖、糖精钠等，常用的防腐剂包括苯甲酸、脱氢乙酸、山梨酸、纳他霉素等，《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）^［4］中均有收载，并对其允许使用的食品类型和使用限量作出了明确规定：不得在未处理的新鲜水果中直接使用。目前国标方法包括《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》（GB 5009.28—2016）^［5］、《食品安全国家标准 食品中纳他霉素的测定》（GB 5009.286—2022）^［6］、《食品安全国家标准 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》（GB 5009.298—2023）^［7］、《食品安全国家标准 食品中乙酰磺胺酸钾的测定》（GB 5009.140—2023）^［8］等，但未有适用的方法可同时检测新鲜水果中多种防腐剂和甜味剂。

目前文献报道的针对添加剂的检测方法主要包括高效液相色谱法^［9-11］，但液相方法的前处理过程、液相色谱检测条件均不相同，其中三氯蔗糖如果用液相法测定则须用蒸发光散射检测器或者示差折光检测器，其余添加剂则使用紫外检测器在不同波长下测定，因此无法将不同种类的添加剂同时测定。气相色谱法^［12-13］ 和气相色谱-质谱联用法^［14-15］测定添加剂则需要进行衍生化反应。近年来，液相色谱-质谱联用法^［16-19］因仪器稳定性好、灵敏度高、通用性强，逐渐成为主流检测仪器。该研究针对几种不同水果基质，以10种水果中使用可能性较高的食品添加剂为目标化合物，采用优化的前处理方法结合超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法，建立能高通量快速测定杨梅、桑葚等水果中多种添加剂的通用分析方法，并利用该方法分析市场上流通的水果。

1材料与方法

1.1试验材料

TripleQuad5500三重四极杆/线性离子阱串联质谱，美国ABSciex公司；LC-30AD超高效液相色谱，日本Shimadiu公司；Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司；XPE-205电子天平，瑞士Mettlertoledo公司；KS4000ic低温摇床，德国IKA公司；MultifugeXIR高速离心机，美国Thermo公司；KH-500DV型超声波清洗器，民山禾创公司。

甲醇、乙腈，色谱纯，德国默克公司；甲酸，质谱纯，美国RoeScientificing公司；乙酸铵，质谱纯，德国CNW公司。

苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准溶液均购自中国计量科学研究院，浓度均为1.0mg/mL；脱氢乙酸标准品购自ChemService，纯度为99.5%；纳他霉素标准品购自Dr.EhrenstorferGmbH，纯度为90.41%；甜蜜素标准品购自Dr.EhrenstorferGmbH，纯度为99.0%；安赛蜜标准品购自Dr.EhrenstorferGmbH，纯度为99.69%；三氯蔗糖标准品购自中国食品药品检定研究院，纯度为99.9%；纽甜标准品购自Sigmaaldrich，纯度为99.4%；甜菊糖苷标准品购自中国食品药品检定研究院，纯度为100%。

1.2试验方法

1.2.1标准溶液的配制。

1.2.1.1标准储备液。购买的苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准溶液可直接作为相应的标准储备液。分别称取甜蜜素、安赛蜜、三氯蔗糖、脱氢乙酸标准品约10mg置于10mL容量瓶中，加入水超声溶解，并定容至刻度，配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备液，于4℃下避光保存。分别称取纳他霉素、纽甜、甜菊糖苷标准品约10mg置于10mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备液，于-18℃下避光保存。

1.2.1.2

混合标准溶液。准确吸取安赛蜜、纽甜、甜菊糖苷标准储备液各0.1mL，甜蜜素标准储备液0.2mL，脱氢乙酸、纳他霉素标准储备液各0.8mL，糖精钠、三氯蔗糖、苯甲酸、山梨酸标准储备液各1.6mL于10mL容量瓶中，用乙腈-甲醇-水溶液（V∶V∶V，1∶1∶1）定容至刻度，配制成混合标准溶液，于4℃以下避光保存，有效期90d。

1.2.1.3混合标准系列工作溶液。分别准确吸取上述混合标准溶液0.01、0.02、0.05、0.08、0.10、0.15和0.20mL，用相应类别的空白样品基质液定容至10.0mL，配制成安赛蜜、纽甜、甜菊糖苷质量浓度分别约为10、20、50、80、100、150和200ng/mL，甜蜜素质量浓度分别约为20、40、100、160、200、300和400ng/mL，脱氢乙酸、纳他霉素质量浓度分别约为80、160、400、640、800、1200和1600ng/mL，糖精钠、三氯蔗糖、苯甲酸、山梨酸质量浓度分别约为160、320、800、1280、1600、2400和3200ng/mL的混合标准系列工作溶液。临用现配。

1.2.2样品处理。用均质器将样品充分打碎混匀，放入分装容器中。称取2.0g处理好的试样，置于50mL离心管中，加入30mL乙腈-甲醇-水溶液（V∶V∶V，1∶1∶1），高速振荡提取10min，超声10min，5000r/min离心10min，收集上清液至50mL容量瓶中，加入10mL乙腈-甲醇-水溶液重复提取一次，合并上清液至50mL容量瓶，用水定容至刻度，如有需要，则用水稀释合适倍数。过0.22μm滤膜过滤后上机分析。

1.2.3色谱条件。WatersAcquityUPLCHSST3C18色谱柱（2.1mm×100mm，1.8μm）；流动相A为5mmol/L乙酸铵水溶液，B为乙腈-甲醇（V∶V，1∶1）。流速0.3mL/min；柱温35℃；进样量2μL。梯度洗脱程序见表1。

1.2.4质谱条件。

电离方式为电喷雾电离（ESI-）；检测方式为多反应监测MRM；喷雾电压（IS）4500V；离子源温度（TEM）350℃。优化后的母离子、子离子和碰撞电压（CE）、去簇电压（DP）、射入电压（EP）、碰撞室射出电压（CXP）等质谱参数见表2。

2结果与分析

2.1仪器条件的优化

2.1.1质谱条件的优化。使用针泵进样，分别在正负离子模式下进行Q1扫描，所有化合物在负离子模式下响应较好，因此使用负离子模式确定准分子离子峰，使用产物离子模式扫描，选择响应最强的2个子离子分别作为定量离子和定性离子，并在MRM模式下优化各质谱参数。去簇电压（DP）主要是影响离子进入质谱的速度，可消除溶剂离子簇，DP越大，离子速度快，离子损失小，去簇效果越好，检测灵敏度高，反之则相反。因此理论上DP越高越好，但过高的DP会增加离子间的碰撞，引起较强的源内裂解。试验过程中发现安赛蜜、脱氢乙酸、苯甲酸、山梨酸等对DP非常敏感，当DP过大时，几乎监测不到母离子，通过针泵进样，优化DP，优化后的参数见表2。

2.1.2色谱条件的优化。目标化合物在C18色谱柱上均可保留，WatersAcquityUPLCHSST3C18色谱柱（2.1mm×100mm，1.8μm）相对于其他C18色谱柱对各目标化合物有更好的保留，且无杂峰干扰，分离效果较好，因此选用WatersAcquityUPLCHSST3C18色谱柱作为分析柱。在优化的质谱条件下，比较了乙腈-甲醇（V∶V，1∶1）溶液、乙腈、甲醇作为有机相的洗脱效果，结果表明乙腈的洗脱能力最强，较甲醇出峰较快，导致多个目标峰重叠，用甲醇作为有机相时，峰形明显不如乙腈作为有机相时尖锐对称，使用乙腈-甲醇（V∶V，1∶1）溶液作为有机相可综合甲醇和乙腈的优点，各目标化合物峰形对称且分离效果相对较好。在负离子扫描模式下流动相中加入少量乙酸铵可促进各目标化合物的解离，使响应变好，因此选择5mmol/L乙酸铵水溶液和乙腈-甲醇（V∶V，1∶1）溶液作为流动相系统。10种添加剂的典型图谱见图1。

2.2样品前处理优化

2.2.1提取溶剂的选择。10种食品添加剂包括防腐剂和甜味剂，种类不同，性质差异较大，在不同溶液中的溶解性也存在差异性。该试验中尝试采用直接提取的方式将不同性质的添加剂提取出来，提取溶剂的选择较为重要。为了更好地提取样品中10种食品添加剂，根据其溶解性对提取溶剂进行了考察。对比了乙腈、甲醇、水和乙腈-甲醇-水溶液（V∶V∶V，1∶1∶1）对10种添加剂的提取效果。其中纳他霉素、纽甜和甜菊糖苷易溶于甲醇等有机试剂，难溶于水。安赛蜜随有机相比例增加提取效率有所降低，使用纯有机相和乙腈-甲醇-水溶液（V∶V∶V，1∶1∶1）提取时，安赛蜜在色谱上的峰会出现分裂的现象，但用水稀释后可重新使色谱峰尖锐对称。苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠、安赛蜜、三氯蔗糖用纯水即可完全提取。综合考虑，最后采用乙腈-甲醇-水溶液（V∶V∶V，1∶1∶1）作为提取试剂，并用纯水定容及稀释。

2.2.2提取时间的优化。水果样品基质中含水量较高，含有的蛋白质脂肪等杂质较少，采用直接提取后进样的方式对色谱柱及质谱检测器的损害较小。该试验中采用振荡提取和超声的方式从样品中提取目标化合物。在阳性样品测定过程中发现，提取时间和方式对苯甲酸、山梨酸的提取效果影响较为明显，对其他化合物影响不明显。分别采用振荡20min、超声20min、振荡10min后超声10min进行提取，结果发现振荡10min后超声10min进行提取测得的含量最高，再延长提取时间对结果影响不大，因此选择振荡10min后超声10min进行提取。

2.3线性关系和方法检出限

根据检测情况发现桑葚和杨梅是2类添加剂检出率较高的水果，因此选择桑葚和杨梅作为目标样品。在样品加标试验过程中发现存在一定的基质效应，因此采用样品空白基质液配制标准曲线溶液，以抵消基质效应。分别考察其样品空白基质液中目标化合物的线性关系及方法灵敏度。以相应样品的空白基质液配制系列浓度混合标准溶液，以待测物质的峰面积为纵坐标（Y）、相应目标化合物的质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线。各目标化合物的线性范围、线性方程及相关系数（R2）详见表3。根据3倍信噪比（S/N）及10倍信噪比（S/N）分别确定各目标物的方法检出限（LOD）和定量限（LOQ）。结果表明，10种添加剂在质量浓度为10.59～3260.67ng/mL线性关系良好（R2≥0.9938），方法检出限为0.02～1.50mg/kg，定量限为0.25～4.00mg/kg。

2.4精密度和回收试验

分别选择桑葚和杨梅样品进行加标试验，加标浓度为2倍（低水平）、5倍（中水平）、10倍（高水平）定量限浓度，每个浓度设定6份平行样，分别考察回收率和相对标准偏差（RSD），结果表明（表4～5），2种基质中各目标化合物的平均回收率为85.21%～108.92%，RSD为0.74%～9.63%。混标工作液重复进样6次，计算仪器精密度，RSD为0.96%～4.53%。这表明该方法具有较好的准确性和精密度。

2.5实际样品测定

利用建立的方法检测市场上购买的24批次桑葚，结果发现（表6），7批次检出脱氢乙酸，5批次检出糖精钠，3批次检出甜蜜素，2批次检出纽甜，1批次检出三氯蔗糖，检出问题样品7批次，问题发现率29.2%。检测20批次杨梅，结果发现（表7），1批次检出糖精钠，2批次检出甜蜜素，4批次检出脱氢乙酸，检出问题样品5批次，问题发现率25.0%。

3结论

该试验利用乙腈-甲醇-水溶液（V∶V∶V，1∶1∶1）振荡和超声提取，并用纯水稀释定容，结合超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法建立了同时测定桑葚、杨梅水果中10种添加剂的方法，对提取方法、仪器条件进行了优化，确定了一种样品前处理方法，解决了其他类型仪器难以同时测定多种不同类型添加剂的问题。经方法学验证，该方法的线性、回收率、重复性、定量限、检出限等均满足多种添加剂检测技术的要求。该方法简单、快速、可高通量同时检测10种常用的食品添加剂，大大节省检测时间，适合大批量样品的快速筛查；检测成本低，整个过程对环境污染也较小。建立的方法能广泛应用于桑葚、杨梅等新鲜水果中添加剂的分析检测，后续可继续应用于检测草莓、蓝莓等不易保存的水果中防腐剂及添加剂的情况。

参考文献

［1］解楠.高效液相色谱法同时测定饮料和果冻中9种食品添加剂［J］.食品安全质量检测学报，20212（4）：1524-1530.

［2］高敏国，陆小燕.我国几类食品添加剂滥用现状、危害及应对措施［J］.职业与健康，20129（24）：3351-3353.

［3］王嘉宁.食品中常见甜味剂使用方面存在的主要问题及危害［J］.农村科学实验，2019（2）：42-43.

［4］中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品添加剂使用标准：GB2760—2014［S］.北京：中国标准出版社，2014.

［5］中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定：GB5009.28—2016［S］.北京：中国标准出版社，2016.

［6］中华人民共和国国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准食品中纳他霉素的测定：GB5009.286—2022［S］.北京：中国标准出版社，2022.

［7］中华人民共和国国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定：GB5009.298—2023［S］.北京：中国标准出版社，2023.

［8］中华人民共和国国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准食品中乙酰磺胺酸钾的测定：GB5009.140—2023［S］.北京：中国标准出版社，2023.

［9］林腾奕，陈思敏，梁旭霞，等.超高效液相色谱法同时测定饮料中20种食品添加剂［J］.食品安全质量检测学报，2020，11（2）：500-506.

［10］钟菲菲，雷德卿，周金沙，等.高效液相色谱法检测药品糖浆剂中4种人工合成甜味剂［J］.食品与机械，2022，38（7）：75-79.

［11］孙稚菁，任国杰，王灵芝，等.果脯蜜饯和果冻中10种食品添加剂的同时测定［J］.食品研究与开发，2017，38（7）：133-137.

［12］何亚芬.气相色谱法同时检测食品中9种常见食品添加剂方法的建立与应用［D］.南昌：江西农业大学，2020.

［13］YUSB，ZHUBH，LVF，etal.Rapidanalysisofcyclamateinfoodsandbeveragesbygaschromatography-electroncapturedetector（GC-ECD）［J］.Foodchemistry，2012，134（4）：2424-2429.

［14］王立媛，刘丛娟，胡争艳，等.三氟化硼乙醚衍生-气相色谱-质谱联用法测定糕点中5种防腐剂［J］.中国卫生检验杂志，20233（18）：2206-2209.

［15］王李平，汤逊尤，张志军，等.响应面优化-气相色谱质谱联用测定食品中山梨酸、苯甲酸和肉桂酸［J］.分析试验室，2018，37（9）：1020-1024.

［16］郑娟梅，莫紫梅，王警，等.液相色谱-串联质谱法同时检测糕点中31种食品添加剂［J］.中国食品添加剂，20232（4）：70-80.

［17］刘文菁，苏晓明，李健，等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定糖果中24种添加剂含量［J］.食品科技，2022，47（8）：282-288.

［18］程水连，何建国，卢桂英，等.食品中多组分甜味剂和防腐剂同时快速测定方法的建立［J］.食品与机械，2020，36（1）：88-94.

［19］王骏，宿书芳，胡梅，等.超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱筛查水果罐头中37种食品添加剂［J］.食品与发酵工业，2017，43（11）：212-219.