假单胞菌与褐藻寡糖协同提高梨果实产量及品质

关键词： 根际促生菌； 生物刺激素； 褐藻寡糖； 梨； 产量； 品质

随着全球对可持续农业发展的关注不断加强，减少化肥使用并提高作物对环境胁迫的适应能力成为当前研究的重点。在这一背景下，生物刺激素的开发和应用受到了广泛关注。欧洲生物刺激剂工业委员会（EBIC） 将生物刺激素定义为：一种施用至种子、作物或根际后能够刺激其自然生长过程，能增强作物养分吸收、肥料利用效率、对非生物胁迫的耐受性，进而提高品质和产量的物质，分为微生物型和非微生物型[1]。非微生物型生物刺激素主要包括腐植酸、氨基酸、几丁质及其衍生物、海藻提取物、蛋白水解物等物质。5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）和γ-氨基丁酸（GABA） 作为非蛋白氨基酸，已被证实可显著促进作物光合效率和生长性能，提高作物应对低温、干旱、盐碱等逆境的能力，提升产量和果实品质[2−6]。海藻提取物中富含的多糖（如海带多糖、卡拉胶和海藻酸盐） 及甾醇和含氮化合物（如甜菜碱和植物激素），均对促进作物生长发挥积极作用[7]。褐藻寡糖（AOS） 作为一种新型海藻提取物，其分子量低、黏性小和生物活性强，已证实在抵抗非生物胁迫和提高果实品质方面具有重要作用[8−9]并延长果实货架期[10]。微生物型生物刺激素是指根际促生细菌、促生真菌等微生物。王中华等[11]研究发现，施用酸快生芽孢杆菌可以有效改善土壤养分，提高花生和玉米产量与品质。赵兴丽等[12]研究表明，钩状木霉对辣椒具有促生作用，根际施用后显著提高辣椒幼苗的根长及生物量。面对复杂的土壤环境和多种非生物胁迫时，实验室条件下分离到的根际高效促生菌株在施入土壤后通常效果减弱或消失，如何增强功能菌的根际定殖是田间效果稳定性的关键，其中既可发挥对植物的促进作用又有利于功能菌生长的非微生物型生物刺激素越来越受到关注。Sani等[13]发现，海藻提取物和木霉的配合使用可显著改善番茄生长和果实品质，施用复合生物刺激素效果更稳定。本研究以从梨树根际分离获得的土著促生菌株和促进梨苗生长的非微生物型生物刺激素为切入点，探究其复配对梨苗或梨果实产量和品质的影响，探讨复合型生物刺激素有利于促生菌在根际定殖从而稳定发挥功能的可能机制，为减少化肥施用及微生物肥料研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

生物刺激素：褐藻寡糖（AOS）、5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）、γ-氨基丁酸（GABA），均为广西汉和生物科技股份有限公司惠赠，其质量浓度分别为300、40、400 g/L。

根际促生菌：从梨树根际分离、筛选的128 株具有产IAA 能力的土著细菌。

植物材料：杜梨（Pyrus betulifolia Bunge）、丰水梨（Pyrus pyrifolia Nakai. cv. Hosui）。

1.2 试验方案

1.2.1 梨树根际促生菌的筛选 1） 杜梨育苗 杜梨种子在去离子水中浸泡12 h 后，用75% 酒精浸泡1 min，无菌水冲洗3～5 次，2% （v/v） 次氯酸钠溶液浸泡15 min，无菌水冲洗5 次。消毒好的杜梨种子均匀地平铺在灭菌的纱布上催芽3～5 天，挑选萌发的种子点播于灭菌的穴盘基质中，至杜梨长出3 片真叶时移栽至灭菌基质中。

2） 梨树根际促生菌的筛选与验证 将128 株细菌在TSA 培养基上进行分离与纯化。选取纯化后的单菌落，将其转接至T SB 液体培养基中，并在28℃、170 r/min 的条件下培养过夜以活化菌株。取10 μL 活化后的菌悬液分别点接到4 种不同的专用培养基（阿须贝固氮培养基、亚历山鲍罗夫解钾培养基、蒙金娜有机磷培养基以及PKO 无机磷培养基）上，每株菌设3 次重复。接种后的培养基在28℃ 条件下培养7 天。根据菌株在培养基中形成的透明圈直径（D） 与菌落直径（d） 的比值评估菌株的促生特性。存在透明圈（即D/d 比值大于零） 标识为“+”，表明菌株具备相应的能力；若无透明圈形成，则标记为“−”，表示菌株在该条件下不具备相应的能力，统计各菌株功能的数量。为进一步验证筛选到的多功能细菌对梨苗的促生作用，进行灭菌基质盆栽接菌试验。设置单细菌菌液接种处理，以不接种为空白对照（CK），每个处理12 次重复。梨苗移栽1 周后接种细菌悬液（终浓度为 107 CFU/g 基质），培养 30 天后收获。

3） 菌株分子生物学 16S rDNA 鉴定及系统发育树构建 纯化筛选所得的梨树根际促生菌，由生工生物工程（上海） 股份有限公司南京分公司进行PCR 扩增及测序。引物采用16S rDNA 扩增通用引物（27F：5'−AGAGTTTGATCCTGGCTCAG−3'；1492R：5'−GGTTACCTTGTTACGACT T−3'）。根据 16SrDNA 基因序列的测序结果，在EzBiocloud 数据库中进行比对分析，并利用MEGA 11 软件采用邻接法（neighbor-joining method） 构建系统发育树。

1.2.2 不同种类及浓度的生物刺激素对梨苗生长的影响 生物刺激素稀释液制备：分别取1 mL 褐藻寡糖、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸溶液用无菌水分别稀释1000 和2000 倍，分别简写为AO-1、AO-2、ALA-1、ALA-2、G-1 和G-2。梨苗培养同上，每个处理设12 次重复，生长30 天后收获。

1.2.3 梨树根际促生菌CD1 与褐藻寡糖单施或复配对梨苗生长的影响 以清水为对照（CK），设置单接种假单胞菌CD1、单施褐藻寡糖1：1000 稀释液、假单胞菌CD1 与褐藻寡糖稀释液复配4 个处理。每个处理设12 次重复，杜梨生长40 天后收获。

1.2.4 梨树根际促生菌CD1 与褐藻寡糖复配田间试验

于2023 年，在江苏省南京溧水白马教学基地进行试验。以4 年生“丰水”梨为试验梨树，以清水为对照（CK），设置单接假单胞菌CD1 菌液（终浓度为107 CFU/g 土）、单施褐藻寡糖1：1000 稀释液、假单胞菌CD1 菌液与褐藻寡糖稀释液复配灌根处理，分别于2023−04−14、2023−04−30、2023−05−19 在梨树两侧采用穴施法倒入上述液体，每棵树浇灌2 L。每个处理5 棵树，单株为1 次重复，各处理其他田间管理条件一致。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 植物生长指标测定 分别使用卷尺和游标卡尺测定杜梨苗株高、茎粗。使用手持式SPAD 仪（KONICAMINOLTA SPAD-502Plus） 测定叶片SPAD 值。采用叶面积测定仪SYE-YM02 测定叶面积。将植株清洗干净，地上、地下部分（根） 分开，蒸馏水冲洗表面，吸干表面水分。置于烘箱中105℃杀青30 min 后于75℃ 烘干至恒重，称量地上部和根系干重。使用WinRHIZO 根系扫描仪分析根系形态。

1.3.2 果实品质指标测定 样品采集：在果实成熟期8 月中旬，统计各处理下梨树的果实数量并采集果实样品。在每株树冠外围中部同等受光条件下随机采收10 个果实用于各种指标测定。

果实品质测定：单果质量用称重法、果实纵横径用游标卡尺测定；可溶性固形物含量用ATAGON-1 型折光仪测定；硬度用GY-1 型果实硬度计测定、可滴定酸含量采用滴定法[14]；果实可溶性糖含量用蒽酮比色法[15]；石细胞采用冷冻法[16]测定。

果实矿质养分含量的测定：果实中微量元素养分测定采用HNO3−HClO4 消煮法，大量元素养分采用H2SO4−H2O2 消煮，然后利用ICP-OES 仪测定分析[17]。养分积累量为养分含量与果实干重的乘积。

1.4 数据处理与分析

单株产量=平均单果重×平均果实数量；

果实含水率（%）=（果实鲜重−果实干重）/果实鲜重×100%；

果实干重（g）=果实鲜重−（果实鲜重×含水率）；

果实养分积累量=果实养分含量×果实干重。

使用Microsoft Excel 2019 进行数据整理与初步分析，统计分析采用SPSS 26.0 （IBMCorp， Armonk，USA） 和RStudio 4.2.3 软件。使用GraphPad Prism 9软件进行图表绘制。利用Adobe Photoshop CS6 进行图片处理。

2 结果与分析

2.1 梨树根际促生菌的筛选与鉴定

2.1.1 多功能细菌筛选 如表1 所示，128 株梨树根际初步分离到的土著菌株在固氮、解钾、解有机磷和无机磷方面存在较大差异，其中获得11 株多功能菌株，包括3 株具有4 种功能的菌株（GH1、EE9和GB8），7 株具有3 种功能的菌株有（CD1、GH4、GD4、QD11、QE1、NF7 和LH2），1 株具有2 种功能的菌株有（QE2）2.1.2 盆栽验证 如表2 所示，所有接菌处理相对于对照组在茎粗、叶片SPAD 值、叶面积以及地上部和根系生物量等指标上均有不同程度的提升效果。其中，菌株CD1 在增加茎粗和叶片SPAD 值方面效果较好，与CK 相比，茎粗提高20%，SPAD 值显著提高24.5%；菌株GB8 和CD1 使叶面积分别显著提高51.8% 和50.6%；菌株CD1 使梨苗总生物量显著增加60%。另外，菌株CD1 在梨苗根体积和根尖数上表现出显著的提升效果，与CK 相比，两指标分别提高了71.4% 和101.9%。上述结果表明，菌株CD1 在促进梨苗生长和根系发育方面效果最佳。

2.1.3 根际促生菌CD1 16S rDNA 基因同源性比较

根据 16S rDNA 的测序结果和 EzBiocloud 中已登录的核苷酸序列进行同源性比较，发现菌株 CD1 与Pseudomonas wayambapalatensis RW3S1 （AM911665）同源性达到99.48%。系统发育树表明，菌株CD1 与Pseudomonas wayambapalatensis RW3S1 （AM911665）位于同一分支，说明它们具有高度同源性，属于假单胞菌属（图1）。

2.2 不同种类及浓度的生物刺激素对梨苗生长的影响

如图2 所示，所有生物刺激素处理相比对照组对梨苗生长均有不同程度的促进效果，相较于5-ALA 和GABA，褐藻寡糖稀释1000 倍（AO-1） 增加茎粗、叶面积和生物量的效果最为显著，与CK 相比，茎粗、叶面积和生物量分别提高了2 2 . 9 %、49.4% 和38.3%。AO-1 处理也显著促进了梨苗根系生长，与CK 处理相比，根系长度、根表面积和根体积分别显著提高了109.1%、76.7% 和47.9%。

2.3 梨树根际促生菌与褐藻寡糖对梨苗生长的影响

与CK 相比，单施AOS、单接CD1 以及AOS+CD1 均显著促进了梨苗的生长和根系发生（图3），其中AOS+CD1 复配处理效果最为显著，相比CK，株高、茎粗、SPAD 和叶面积分别增加了114.3%、54.9%、30.1% 和107.9%，植株生物量（总干重） 显著提高158.8%，根系长度和体积分别增加了33.7% 和65.5%；与单接CD1 和单施AOS 相比，梨苗生物量分别提高59.0% 和46.7%，根系长度分别增加23.2%和26.3% （表3）。

2.4 梨树根际促生菌与褐藻寡糖对田间梨果实生长及品质的影响

2.4.1 对果实纵横径动态变化的影响 与CK 处理相比，单施AOS、单接CD1 以及AOS+CD1 均促进了不同生育期果实纵横径的增加（图4），其中AOS+CD1 复配处理效果最好。相比CK，处理后43、58、73 和88 天，果实的纵径分别增加了19.6%、19%、24.2% 和16.3%，果实横径分别增加了15.7%、14%、17.4% 和18.2%。

2.4.2 对单株产量和果实品质指标的影响 由图5可知，与CK 相比，单施AOS、单接CD1 以及AOS+CD1 均可显著增加梨单果重，增幅分别为31%、31.7%和45.5%，其中，AOS+CD1 处理对单果重提高幅度最大。所有处理均较大程度提高单株产量，其中单施AOS 和CD1 分别提高51.32% 和57.9%，而AOS+CD1 处理提升幅度达73.7%，比单接CD1 和单施AOS 处理分别提高10.0% 和14.8%。与CK 相比，单接CD1 以及AOS+CD1 均增加了果实的可溶性糖含量和糖酸比，其中AOS+CD1 复配处理效果最为显著，相比CK，其可溶性糖含量和糖酸比分别增加了64.2% 和57.9%，果实可溶性糖含量比CD1 和AOS 处理分别提高29.0% 和61.8%。尽管单接CD1处理轻微降低了果实的可滴定酸含量（降低幅度为8.6%），但未达到显著差异。单施AOS、单接CD1以及AOS+CD1 均显著降低了石细胞含量，其中单接CD1 以及AOS+CD1 效果最为显著，相比CK，分别降低了64.8% 和63.6%，相比AOS，复配处理下石细胞含量显著降低43.1%，优于AOS 单独应用的效果。

2.4.3 褐藻寡糖与假单胞菌对果实养分含量及积累量的影响 由图6 可知，不同处理对“丰水”梨果实的养分含量和养分积累量均产生了显著影响。与CK处理相比，AOS、CD1 以及AOS+CD1 复配处理在果实N、P、K、Ca、Mg、Cu、Zn 和B 元素含量上呈现不同程度的提升，其中，AOS+CD1 复配处理在提升N、P 和Ca 元素含量方面表现最为突出（图6a）。图6b 进一步证实了这些处理对果实养分积累量的积极影响，尤其在N、P、K、Ca、Mg 和Fe 等关键营养指标上，AOS+CD1 复配相较于单独的AOS 和CD1 处理表现出更高的养分积累量。果实养分积累量由干重和养分含量共同决定，由表4 可知，复配处理下果实干重比CK 提高了52.8%，高于AOS 和CD1处理对干重的增加程度。同时，与CK 相比，复配处理使果实中大部分营养元素含量增加，而单施处理下养分含量均有不同程度降低，这表明复配处理不仅能使果实干重增加，也能同时增加果实养分含量。

3 讨论

3.1 褐藻寡糖与梨树根际促生菌具有协同作用

尽管生物刺激素的应用已在农业上取得较大进展，但在不同作物和环境条件下的最佳种类和用量仍是合理使用的关键。本研究探讨了5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸和褐藻寡糖对梨苗生长的促进作用，发现褐藻寡糖在1：1000 稀释浓度下效果最佳，与冯敬涛等[18]的研究结果相一致。冯敬涛等[18]研究发现，水杨酸、脱落酸和海藻提取物处理均能缓解苹果幼苗干旱胁迫，其中海藻提取物效果最佳，在中、重度干旱条件下显著提高幼苗的光合速率和抗氧化能力。同样，Rayorath 等[19]关于泡叶藻提取物对拟南芥根生长的研究也表明，生物刺激素发挥促生效应与其浓度高低有直接关系，通常情况下较低浓度有利于促进作物生长而高浓度可能抑制生长。

在土壤环境和多种非生物胁迫下，根际促生菌的效果往往不稳定，土著微生物的竞争和复杂的土壤环境条件使其难以形成占主导地位的种群并发挥有效的功能，如何增强细菌的根际定殖是田间效果稳定性的关键。有研究表明外源添加特定有机类物质能够显著促进功能菌在根际的生长和定殖，如添加树皮藻酶解液（UPP） 可以促进细菌生物膜形成，增强菌株定殖能力[20]。卜宁等[21]研究发现，褐藻寡糖在0.625～1.25 g/L 浓度范围对双歧杆菌的体外生长有显著的促进作用。本研究也发现，浓度在0.6～1.2 g/L褐藻寡糖对菌株CD1 生长表现出明显的促进作用（数据未发表），表明在适宜浓度下CD1 可以利用褐藻寡糖作为碳源和氮源促进自身生长和代谢，有利于其在根际环境下定殖形成核心物种并发挥作用，增强其效果稳定性，暗示非微生物型生物刺激素在促进根际细菌生长定殖方面具有潜在重要作用，有待于开展进一步深入研究。

3.2 褐藻寡糖与根际促生菌的复配有利于产量和品质同步提升

大量关于根际促生菌（PGPR） 的研究表明，其对作物生长具有显著促进作用，特别是产IAA、溶磷、解钾、固氮的根际促生菌[22−24]。本研究中筛选的梨树促生菌具有多种上述功能。盆栽试验显示，褐藻寡糖与促生菌CD1 的复配处理显著促进梨苗生长，与王奎萍等[25]及Prittesh 等[26]关于解磷、固氮、产IAA 的促生菌活性与作物生长呈正相关性的研究结果一致。通常情况下，作物的产量和品质存在明显的负相关关系。本研究中褐藻寡糖和根际促生菌CD1 的单独或复配使用均能显著提高梨树果实的产量和品质，尤其是二者的复配不仅显著促进果实的生长及单株产量，而且在提高可溶性糖含量、糖酸比以及降低石细胞含量方面表现突出，能够协同提高产量和品质，这对实现高产优质的生产目标具有重要意义。本研究还发现，复配处理不仅能使果实干重增加，也能同时增加果实中大部分营养元素含量，表明有更多的光合产物和矿质元素运输到果实，提高了植株对土壤中营养元素的吸收能力，养分利用效率得到提高。本研究中复配处理促生效果明显的原因可能有如下几个方面：1）功能菌CD1来自梨树根际分离的土著菌株，从相似植物背景环境中分离出来的同源微生物具有宿主优势效应，从而更易发挥促生作用；2）褐藻寡糖具有延缓植物衰老和调控生长素相关基因的表达，促进IAA 的合成和运输，促进植物生长及增强根际微生物活性等功能[27]；3）褐藻寡糖促进了CD1 菌株在根际的存活或定殖，有利于CD1 功能发挥，具体促生机制有待进一步开展研究。

4 结论

本研究筛选到在梨苗或梨树上具有显著促生效果的假单胞菌（CD1） 和褐藻寡糖（AOS），CD1与A O S 复配可显著促进植株生长和侧根发生（ZL202311758216.X），应用于结果期梨树上也可显著促进梨果生长和提高产量，明显改善果实品质，可以在生产中推广应用。