周期素依赖性蛋白激酶抑制物1A相互作用锌指蛋白1在结直肠癌中的表达及其临床意义

[摘要]"目的"分析结直肠癌组织中周期素依赖性蛋白激酶抑制物1A相互作用锌指蛋白1（Ciz1）的表达情况并探讨其在临床诊断和治疗中的潜在意义。方法"采用免疫组化技术和Western"blot法，对结直肠癌组织、正常癌旁结直肠组织中Ciz1表达水平进行检测、对比。结果"结直肠癌组织原发灶表中，Ciz1明显增加，阳性率与正常组织比较，差异有统计学意义（Plt;0.05）。采用Western"blot法定量分析，结果显示结直肠癌组织Ciz1的表达量为0.32±0.03，正常大肠黏膜组织中的表达量为0.11±0.01，二者间差异有统计学意义（Plt;0.05）。Ciz1在结直肠癌组织中过度表达与多个临床病理特征密切相关。患者的年龄、性别、肿瘤部位、分化程度，以及是否存在远处转移与此并无关联（均Pgt;0.05）。结直肠癌组织中Ciz1的表达水平升高，与结直肠癌的T分期（P=0.018）、淋巴结转移（P=0.022）以及美国癌症联合委员会（American"Joint"Committee"on"Cancer，AJCC）分期（P=0.017）密切相关。结论"Ciz1在肿瘤分期过程中参与了肿瘤的发展和扩散。可以预见Ciz1有望成为一项新的标志物，用于评估结直肠癌患者的预后情况。

[关键词]"Ciz1；结直肠癌；免疫组化

[中图分类号]"R735.3""""""[文献标识码]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.23.017

Expression"and"clinical"significance"of"Ciz1"in"colorectal"cancer

CAO"Jin，"GAO"Fangyuan，"SUN"Shengbo，"ZHANG"Huanhu，"HAN"Chuanji，"GONG"Qing，"LI"Gangxing

Department"of"Gastrointestinal"Surgery，"Weihai"Municipal"Hospital"Affiliated"to"Shandong"University，"Weihai"264202，"Shandong，"China

[Abstract]"Objective"To"observe"the"expression"of"ciz1"in"human"colorectal"cancer"tissues"and"analyse"the"relationship"between"their"expression"and"clinicopathologic"features."Methods"We"detected"the"expression"of"Ciz1"and"Ciz1"mRNA"by"immunohistochemistry"and"Western"blotting."The"relationship"between"the"expression"of"ciz1"and"clinicopathologic"features"was"analied."Results"According"to"immunohistochemical"results，"Ciz1"showed"significant"high"expression"in"the"primary"lesion"of"colorectal"cancer"tissue，"compared"to"normal"adjacent"tissues"（66.7%"vs."35.0%，"P=0.001）."Through"Western"blot"analysis，"it"was"found"that"the"relative"expression"level"in"colorectal"cancer"tissue"was"0.32"±"0.03，"while"in"normal"colorectal"mucosal"tissue"it"was"0.11"±"0.01."In"addition，"the"relative"expression"level"of"Ciz1"in"colorectal"cancer"tissue"was"significantly"higher"than"that"in"normal"intestinal"mucosal"tissue"（Plt;0.05）."The"study"found"that"the"overexpression"of"Ciz1"in"colorectal"cancer"tissue"is"significantly"correlated"with"the"T"stage"（P=0.018），"lymph"node"metastasis"（P=0.022），"and"AJCC"stage"（P=0.017）"of"the"cancer."The"age，"gender，"tumor"location，"degree"of"differentiation，"and"the"presence"of"distant"metastasis"of"patients"were"not"correlated"with"this"（Pgt;0.05）."The"expression"level"of"Ciz1"in"colorectal"cancer"tissue"is"significantly"increased，"which"is"closely"related"to"the"T"stage"（P=0.018），"lymph"node"metastasis"（P=0.022），"and"American"Joint"Committee"on"Cancer"stage"（P=0.017）"of"colorectal"cancer."Conclusion"This"association"suggests"that"Ciz1"may"play"an"important"role"in"tumor"staging，"participating"in"the"development"and"spread"of"tumors."Therefore，"it"can"be"foreseen"that"Ciz1"is"expected"to"become"a"new"biomarker"for"evaluating"the"prognosis"of"colorectal"cancer"patients.

[Key"words]"Ciz1;"Colorectal"cancer;"Immunohistochemical

周期素依赖性蛋白激酶抑制物1A相互作用锌指蛋白1（以下简称Ciz1）作为CDK2抑制剂p21Cip1/Waf1的重要相互作用蛋白，在细胞调控机制中扮演着不可或缺的角色[1]。研究表明，Ciz1涉及哺乳动物DNA复制过程，在细胞周期调控、细胞凋亡等诸多关键生物学活动中发挥着调节作用[2]。Ciz1在多种癌症组织中的表达水平上升，Ciz1可能与癌症的发生和发展密切相关。事实上，已有研究报道了Ciz1在肺癌、胆囊癌等多种癌症中的高表达现象[3]。

研究表明，早期肺癌患者血液中Ciz1变种（Ciz1-b）可能成为一种新型、非侵入性的早期肺癌诊断标志物[4]。本研究目的是使用免疫组化和蛋白印迹技术，对Ciz1在结直肠癌患者肿瘤组织和正常癌旁组织中的表达水平进行比较分析。

1""资料与方法

1.1""一般资料

选取2023年1月至12月威海市立医院60例患者的新鲜结直肠癌组织和其癌旁正常组织样本，男性37例，女性为23例；年龄36～85岁，其中36例年龄在60岁及以上，24例年龄在60岁以下。其中结肠癌36例，直肠癌24例。根据结直肠癌美国癌症联合委员会（American"Joint"Committee"on"Cancer，AJCC）分期标准进行分类，在患者群体中，Ⅰ/Ⅱ期共有32例患者，Ⅲ/Ⅳ期则有28例。均经过明确病理诊断和手术切除。高度分化37例，中低分化23例，T1～T2期26例、T3～T4期34例。其中出现局部淋巴转移的有21例。同时，39名患者未发现转移，3名患者远处转移。所有样本采集经威海市立医院伦理委员会审核批准（伦理审批号：2020057）。

1.2""免疫组织化学染色

处理大肠癌蜡块组织标本时，每个样本要准备2张组织切片（每张4μm）。第一张采用HE染色法，明确病理；第二张采用免疫组织化学染色法，完成之后将其放在59℃恒温烤箱内，时间约1h左右，以确保与载玻片紧密黏附。随后依次执行脱蜡、水化、抗原修复和封闭内源性过氧化物酶位点等操作步骤。为了提高实验效果，在勾画范围时最好添加抗体，并有效限制范围防止抗体浪费，之后用PBS洗涤干净。随后滴加特定抗体：例如使用兔源多克隆人Ciz1抗体，并在4℃冰箱中培育约12h。整晚放置在4℃常温冰箱后，执行3次PBS液冲洗处理，接着进行DAB显色、苏木精复染和乙醇梯度脱水处理。最终进行封面镜检步骤同时设置对照组：其中一部分以PBS替代特定抗体，其他流程不变；作为阳性对照则采用已知Ciz1高表达的肺癌组织样本。

根据文献[9]，在对癌旁正常组织切片进行操作时，需要以Ciz1的判读标准为基准。评估每张切片时，要结合标记指数（labelling"index，LI）和染色强度对其进行评分。按照标记指数计分方式来看：当LI≤5%时，0分；LI为5%～25%，1分；LI为25%～50%，2分；LI为50%～75%，3分；LI≥75%，4分。染色强度同样采用四级评分标准：若样本无着色0分；呈淡黄色1分；染色为黄色2分；当染色达到棕黄色时得最高，3分。这一评分过程需要两位专业的病理科技术人员共同参与，以确保评分的准确性和客观性。参考下定义Ciz1的表达水平：0～2为阴性（–），3～5为弱阳性（+），6～8为阳性（++），9～12则视为强阳性（+++）。（-～+）代表Ciz1低表达，（++～+++）表示Ciz1高表达[10]"。

1.3""蛋白免疫印迹技术

首先提取蛋白样品，接着准备标准曲线和使用BCA法测定蛋白浓度。随后，根据Ciz1蛋白的分子量为91kDa，在此基础上选择6%的SDS-PAGE分离胶配制凝胶进行电泳。进行完电泳后，执行转膜、封闭、一抗和二抗孵育步骤，并随后显影样品以计算灰度值。

1.4""统计学方法

采用SPSS"19.0统计学软件对数据进行处理分析，计量资料以均数±标准差（）表示，采用独立样本t检验。计数资料用例数（百分率）[n（%）]表示，采用χ2检验，Plt;0.05为差异有统计学意义。

2""结果

2.1""Ciz1表达情况

Ciz1在细胞内呈现阳性特征，分布集中在细胞质内部，黄色颗粒状。高表达Ciz1中，颗粒为深浓棕黄色。观察结直肠癌组织与癌旁组织的Ciz1表达情况，两者比较差异有统计学意义（图1）。染色强度评分结直肠癌组织中Ciz1高表达率达66.7%，在正常癌旁组织中的高表达率则较低为35.0%，结直肠癌和正常组织Ciz1表达量Western"blot法检测结果见图2。

2.2""结直肠癌组织中Ciz1的表达情况与患者临床病理特征的关系

60个结直肠癌原发灶的实验样本中，有40个样本显示出Ciz1蛋白高表达水平（++～+++）。Ciz1蛋白的过表达与结直肠癌的T分期、淋巴结转移以及AJCC分期之间存在的相关性（Plt;0.05），见表1。

3""讨论

研究结果显示Ciz1在多种肿瘤标本和肿瘤细胞中呈现的高度表达现象[11-12]。这涵盖了多种类型癌症，如肺癌、胆囊癌等。研究者认为Ciz1可能与一系列关键细胞周期蛋白相互作用，如细胞周期蛋白A、E，p21Cip1/Waf1，CDC6或CDK2，对于恶性肿瘤发展、发展均有一定的影响。部分癌症细胞周期蛋白A1的过度表达，也恶性细胞侵袭风险、增殖等原因有关[13]。E1，一种与癌症有关的调节器，有过度表达的情况出现。对于细胞来说，其周期调控的关键是对CDK活性进行有效调节。而且需要和对应细胞周期素相结合，才能对细胞周期进程起到调节的作用。

研究表明，肺癌在早期诊断中，可以通过患者血液中的Ciz1-b来判断。采用蛋白检测，判断Ciz1-b可诊断患者是否处在一期肺癌中。同样的检测方法对于SCLC、NSCLC来说，其准确率已高达98%[4]。这说了Ciz1完全可以作为肺癌肿瘤标志物的检测，以及未来治疗中的新靶点。在大肠癌中的表现同样如此。在本研究中，对包括60个结直肠癌原发灶的实验样本进行了分析。其中，有40个样本显示出Ciz1蛋白高表达水平（++～+++）。将这些数据和患者多个临床病理特点结合在一起，包括性别、肿瘤具体位置、肿瘤分化度等。本研究发现Ciz1蛋白的过表达与结直肠癌的T分期、淋巴结转移以及AJCC分期之间存在的相关性（Plt;0.05）。

综上所述，结直肠癌组织中Ciz1表达明显升高，与结直肠癌T分期和淋巴结转移、AJCC分期等均有关系。这说明Ciz1和结直肠癌的病理分期有着紧密的关系，可能成为判断结直肠癌预后的新标准。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

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