α-细辛醚上调细胞色素C及Caspase-3表达影响食管癌Eca-109细胞的生物学行为

[摘" "要]" "目的：分析α-细辛醚上调细胞色素C（cytochrome C， cytC）及Caspase-3表达对食管癌Eca-109细胞生物学行为的影响。方法：将食管癌Eca-109细胞随机等量分为4组，即低、中及高剂量（分别给予25、50及100 mg/L的α-细辛醚），另随机取等量细胞加入等体积培养液作为空白组，培养48 h后通过平板克隆实验检测4组细胞增殖情况，Annexin V/PI法检测细胞凋亡情况，RT-qPCR及Western Blot法检测细胞中cytC及Caspase-3 mRNA及蛋白表达。结果：（1）细胞克隆数在空白组最高，低剂量组显著高于高剂量组；凋亡率在空白组最低，低剂量组显著低于高剂量组。（2）4组细胞迁移至小室下的细胞数空白组gt;低剂量组gt;中剂量组gt;高剂量组。（3）CytC及Caspase-3蛋白在高剂量组表达显著高于空白组及低剂量组，且中剂量组表达高于空白组。（4）CytC及Caspase-3 mRNA的表达：高剂量组gt;中剂量组gt;低剂量组gt;空白组，差异均有统计学意义（均Plt;0.05）。结论：α-细辛醚抑制Eca-109细胞增殖及侵袭，并且可能通过上调cytC及Caspase-3表达促进调亡。

[关键词]" "α-细辛醚；细胞色素C；Caspase-3；食管癌Eca-109细胞；增殖；凋亡

[中图分类号]" "R735.1" " " " " " " "[文献标志码]" "A" " " " " " " "[文章编号]" "1674-7887（2024）04-0342-04

The influence of α-asarone in biological behavior of esophageal cancer Eca-109 cells by up-regulating expression of cytochrome C and Caspase-3

[Abstract]" "Objective： To analyze influence of α-asarone affects biological behavior of esophageal cancer Eca-109 cells by up-regulating expression of cytochrome C（cytC） and Caspase-3. Methods： Eca-109 cells of esophageal cancer were randomly divided into four groups， low dose， medium dose and high dose groups（administered 25， 50 and 100 mg/L of α-asarone， respectively）， and the same amount of cells severed as the blank group without α-asarone. After 48 hours of culture， the cell proliferation of four groups were detected with plate cloning experiment and apoptosis of cells was detected with Annexin V/PI method， and cytC and Caspase-3 protein and mRNA in cells were detected by RT-qPCR and Western Blot. Results： （1）The number of cell clones was the highest in the blank group， and the low dose group was significantly higher than the high dose group. The apoptosis rate of the four groups was the lowest in the blank group， and the low dose group was significantly lower than the high dose group. （2）Four groups of cells migrated to the cell number blank groupgt;low dose groupgt;medium dose groupgt;high dose group. （3）The expression of cytC and Caspase-3 protein in highdose group was significantly higher than that in blank group and low dose group， and the expression in medium dose group was higher than that in blank group. （4）The expression of cytC and Caspase-3 mRNA in each group was as follows： high dose groupgt;medium dose groupgt;low dose groupgt;blank group（all Plt;0.05）. Conclusion： α-asarone inhibits proliferation and invasion of Eca-109 cells and promotes apoptosis by up-regulating expression of cytC and Caspase-3.

[Key words]" "α-asarone; cytochrome C; Caspase-3; esophageal cancer Eca-109 cell; proliferation; apoptosis

食管癌是我国居民高发恶性肿瘤之一，由于其起病早期症状隐匿，一旦确诊多数患者已处于中晚期，积极治疗预后不佳，死亡率较高[1-3]，早期诊断及有效干预是改善预后、延长生存时间的关键[4]。近年来，随着医学科技的不断发展，临床更加关注食管癌的早期诊断和临床综合治疗，希望能够找到更有效的手段来应对这一严峻挑战。α-细辛醚是从石菖蒲中提取的物质，在心脑血管疾病中发挥保护作用，同时也具备一定的抗癌作用，研究[5]证实其能够调控肿瘤细胞生长、迁移及侵袭等生物学行为，本研究拟分析α-细辛醚对食管癌Eca-109细胞生物学行为的影响。

1" "材料与方法

1.1" "细胞、药品与试剂" "人食管癌Eca-109细胞株，生产批号：KG189，购自南京凯基生物科技发展有限公司。α-细辛醚注射液，规格：2 mL/瓶；生产批号：国药准字H20059986，购自亚宝药业集团股份有限公司。胎牛血清购自Hyclone公司，胰蛋白酶购自Sigma公司，RPM-1640培养基、青霉素及链霉素购自Gibco公司，Annexin V-FITC购自南京凯基生物技术有限公司，结晶紫染色液购自碧云天公司，PCR引物、RNA反转录试剂盒和RT-qPCR试剂盒均购自大连宝生物工程有限公公司，Western Blot试剂盒购自Migma公司，细胞色素C（cytochrome C， cytC）兔抗人单克隆抗体购自Abcam公司，兔抗人Caspase-3抗体购自Proteintech公司，山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2" "仪器" "ABI7500荧光定量PCR仪购自ABI公司，96孔板购自Corning公司，CO2培养箱购自SANYO公司，XDS-1B倒置显微镜购自重庆光电仪器有限公司，Cytoflex流式细胞仪购于贝克曼库尔德公司。

1.3" "实验方法

1.3.1" "细胞培养" "将冻存管中的食管癌Eca-109细胞于室温状态下复苏，放入含10%胎牛血清、链霉素及青霉素的RPMI-1640培养基中，置于5%CO2 37 ℃培养箱中培养，湿度为95%，细胞贴壁符合要求时消化传代，选取对数生长期的细胞备用。

1.3.2" "细胞分组" "依据张妍等[6]团队的研究方法，分别应用生理盐水配制成质量浓度为25、50及100 mg/L的α-细辛醚溶液；选取对数生长期的细胞随机均分为4组，包括空白组、低剂量组（加入25 mg/L）、中剂量组（加入50 mg/L）及高剂量组（加入100 mg/L），空白组加入等体积培养液。

1.3.3" "细胞培养及克隆形成" "配制细胞悬液，调整细胞密度为1×10-4/mL，计数并确保细胞存活率gt;95%，铺于96孔板中，每孔100 μL细胞悬液，设置6个复孔，培养48 h后应用结晶紫染色液进行染色，倒置显微镜下拍照（100×），手工计算细胞克隆形成数。

1.3.4" "Annexin V/PI法检测细胞凋亡" "依据1.3.2方法将配制好的4组细胞接种于96孔板中，每组设置6个复孔，置于同等条件下培养24 h后收集细胞，应用PBS洗涤2次，后加入100 μL Binging buffer重悬，后加入Alexa Fluor 488 annexin V 5 μL和100 μg/mL PI 1 μL，将上述混合体系置于暗室中室温孵育15 min后，应用流式细胞仪进行检测。

1.3.5" "细胞侵袭实验" "在Transwell小室上层放入基质胶，下层放入培养基，而后将1.3.2配置好的4组细胞悬液接种在小室上层，每组细胞各铺6个复孔，按1.3.3方法培养，而后冲洗掉上层细胞及培养基，用甲醇固定后进行结晶紫染色，显微镜下计数。

1.3.6" "Western Blot法检测" "4组细胞由1.3.2方法培养48 h后提取总蛋白，通过BCA蛋白试剂盒测定提取蛋白的浓度，而后提取等量蛋白配置凝胶电泳，进行转膜、封闭，加入兔抗人cytC、兔抗人Caspase-3及β-actin一抗，4 ℃反应条件下过夜，孵育24 h后充分洗涤，加入山羊抗兔二抗，继续孵育1.5 h，应用Bio-Rad凝胶成像仪进行成像，条带灰度值通过Image J软件分析。

1.3.7" "RT-qPCR法检测" "应用Trizol试剂提取1.3.2中4组细胞的总RNA，检测总RNA纯度及浓度合格后进行RT-qPCR；依据RNA反转录试剂盒构建cDNA文库，依据RNA转录试剂盒说明书配置PCR反应体系（总体积为10 μL）后，上机进行RT-qPCR，反应条件为：预变性90 ℃ 10 min，变性 95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 30 s，延伸70 ℃ 30 s，40个循环，通过2-ΔΔCT方程式计算cytC及Caspase-3 mRNA相对表达量；引物序列为：cytC上游引物：5′-TTGCACTTACACCGGTACTTAAGC-3′，下游引物：5′-ACGTCCCCACTCTCTAAGTCCAA-3′；Caspase-3上游引物：5′-GACCTCCTACCTCTGGTTCTT-3′，下游引物：5′-TA-AGCCATGTCCTTCATCACA-3′；内参β-actin上游引物：5′-ATCATGTTTGAGACCTTCA-3′，下游引物：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′。

1.4" "统计学方法" "所有数据通过SPSS 17.0软件进行统计学分析，其中正态分布的数据用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，Plt;0.05表示差异有统计学意义。

2" "结" " " 果

2.1" "细胞克隆数及凋亡率" "细胞克隆数空白组最高，低剂量组显著高于高剂量组；细胞凋亡率空白组最低，低剂量组显著低于高剂量组（均Plt;0.05），见表1、图1。

2.2" "细胞侵袭能力" "显微镜计数可知，4组细胞迁移至小室下的细胞数分别为空白组（192.52±63.21）个、低剂量组（151.43±51.06）个、中剂量组（107.44±49.27）个及高剂量组（63.28±26.56）个，空白组细胞数显著高于其他3组，同时低剂量组高于中、高剂量组，且中剂量组高于高剂量组（均Plt;0.05），见图2。

2.3" "细胞中cytC、Caspase-3蛋白及mRNA表达" "空白组cytC、Caspase-3蛋白表达量显著低于其他3组，且高剂量组cytC、Caspase-3蛋白表达量显著高于中、低剂量组（均P＜0.05），见图3、表2；cytC、Caspase-3 mRNA表达量的顺序为高剂量组gt;中剂量组gt;低剂量组gt;空白组，任意两组间比较差异均有统计学意义（均Plt;0.05），见表2。

3" "讨" " " 论

目前食管癌的临床治疗手段包括手术、放化疗、分子靶向药物及中医药综合治疗等[7-10]，其中手术是首选治疗措施，但上述治疗手段存在手术后肿瘤复发、放化疗部分患者无法耐受、分子靶向药物价格高昂等缺点[11]，且晚期食管癌患者5年生存率仅20%[12]，在我国仍旧有较高的死亡率[13]。中医药被证实在食管癌的治疗中发挥重要价值。细辛醚中的α-细辛醚异构体具备潜在的促进肿瘤细胞凋亡的作用，抑制神经膜细胞瘤侵袭及迁移[14]，而α-细辛醚则被证实具备抑制炎症、促进蜥蜴细胞增殖等作用。近年来发现，α-细辛醚也可能参与了组织细胞的凋亡，动物实验[15]证实其通过调控Caspase-3蛋白表达参与斑马鱼心肌细胞凋亡，也参与了肿瘤细胞的凋亡，主要是通过X连锁凋亡抑制蛋白影响食管癌细胞凋亡[16-17]。众所周知，细胞凋亡涉及多种机制，因此探寻α-细辛醚对食管癌细胞增殖及凋亡影响的其他机制存在临床意义。

本研究发现，α-细辛醚对食管癌Eca-109细胞生物学行为存在影响，可抑制此类细胞的增殖，促进其凋亡，且影响程度与α-细辛醚质量浓度密切相关，随着α-细辛醚质量浓度的增加，Eca-109细胞增殖能力明显下降，凋亡率则明显上升，这与既往研究结果[6， 14， 18]一致。更重要的是，本研究发现α-细辛醚也可影响细胞迁移能力，基于此推测α-细辛醚可能作为治疗食管癌的药物，通过增加肿瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖及迁移。位于线粒体内的cytC是参与细胞凋亡的始动因子，其释放入细胞质后与其他物质形成凋亡体，引起相关凋亡蛋白如Caspase-3的切割及活化，引起细胞凋亡[19-20]。研究[21]指出，氧化应激等促凋亡信号作用下，线粒体内cytC表达增加，募集细胞质中bax前体，促使细胞分子剪切进而活化，激活下游的Caspase-3等家族，切割细胞底物，导致细胞凋亡。

本研究发现，α-细辛醚引起食管癌细胞中cytC及Caspase-3的表达上调，同时随着α-细辛醚质量浓度的增加，上述两者表达上调幅度均显著增加，提示α-细辛醚可能是通过破坏线粒体引起cytC释放至细胞质内，进而引起凋亡蛋白表达及活化增加，参与食管癌细胞凋亡。此外，α-细辛醚同时具备抑制食管癌细胞增殖及侵袭的作用，可能应用于食管癌的治疗，但具体机制尚需深入探讨。

综上，α-细辛醚可抑制Eca-109细胞增殖及侵袭，且通过上调cytC及Caspase-3表达促进凋亡。

[参考文献]

[1]" "冶俊玲， 苟笑丹， 韩静绮， 等. BDNF和TrkB在食管癌组织中表达及BDNF对食管癌细胞生物学行为的影响[J]. 中国老年学杂志， 2020， 40（9）：1828-1832.

[2]" "UHLENHOPP D J， THEN E O， SUNKARA T， et al. Epidemiology of esophageal cancer： update in global trends， etiology and risk factors[J]. Clin J Gastroenterol， 2020， 13（6）：1010-1021.

[3]" "马永超， 程琦， 吴华， 等. 基于Nrf2/ROS信号通路探讨岩藻多糖对食管癌细胞增殖的抑制作用[J]. 食品工业科技， 2024， 45（11）：316-322.

[4]" "SUNG H， FERLAY J， SIEGEL R L， et al. Global cancer statistics 2020： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin， 2021， 71（3）：209-249.

[5]" "王白燕， 张方方， 韩倩倩， 等. α-细辛醚对食管癌Eca-109细胞线粒体凋亡通路的影响[J]. 医药导报， 2018， 37（1）：27-30.

[6]" "张妍， 韩倩倩， 朱艳琴. α-细辛醚诱导的 Eca-109 细胞中cytC、bax的表达[J]. 郑州大学学报（医学版）， 2017， 52（3）：251-254.

[7]" "杨金华， 赵天增， 张岭. 食管癌根治术患者血清microRNA-27a、microRNA-203a-3p表达及与预后的关系[J]. 中国现代医学杂志， 2023， 33（2）：78-83.

[8]" "梁宗英， 赵宝山， 郑竞雄， 等. 乙酰基转移酶KAT2A和Survivin蛋白乙酰化在食管癌中的相关性研究[J]. 临床肿瘤学杂志， 2023， 28（1）：16-22.

[9]" "TAKEUCHI Y， MURAKAMI Y， KAMEOKA T， et al. Analysis of cardiac toxicity after definitive chemoradiotherapy for esophageal cancer using a biological dose-volume histogram[J]. J Radiat Res， 2020， 61（2）：298-306.

[10]" "刘艳娇， 张倩， 何龙英， 等. p16、PADI4在食管癌组织中表达及其与放射治疗后预后的相关性[J]. 中国老年学杂志， 2023， 43（19）：4652-4655.

[11]" "查永嫱， 孙东东， 潘立群. 食管癌术后中医药治疗研究进展[J]. 南京中医药大学学报， 2019， 35（6）：767-770.

[12]" "XIA C F， DONG X S， LI H， et al. Cancer statistics in China and United States， 2022： profiles， trends， and determinants[J]. Chin Med J， 2022， 135（5）：584-590.

[13]" "黄丛改， 刘清， 郑树涛， 等. CXCR2在食管癌组织中的表达及其对食管癌细胞生物学行为的影响[J]. 癌变·畸变·突变， 2024， 36（1）：53-57， 65.

[14]" "LI F， HUANG H M， CHANG D M. Pivalopril improves anti-cancer efficiency of cDDP in breast cancer through inhibiting proliferation， angiogenesis and metastasis[J]. Bio-chem Biophys Res Commun， 2020， 533（4）：853-860.

[15]" "SHANG X L， JI X N， DANG J， et al. α-asarone induces cardiac defects and QT prolongation through mitochondrial apoptosis pathway in zebrafish[J]. Toxicol Lett， 2020， 324：1-11.

[16]" "UEBEL T， HERMES L， HAUPENTHAL S， et al. α-asa-rone， β-asarone， and γ-asarone： Current status of toxicological evaluation[J]. J Appl Toxicol， 2021， 41（8）：1166-1179.

[17]" "LIU B， DAN W C， WEI Y， et al. β-asarone inhibits the migration， invasion， and EMT of bladder cancer through activating ER stress[J]. Cancer Med， 2023， 12（12）：13610-13622.

[18]" "张妍， 何航， 韩倩倩， 等. α-细辛醚对Eca-109细胞凋亡及XIAP、caspase-3表达的影响[J]. 郑州大学学报（医学版）， 2017， 52（4）：377-380.

[19]" "THAKKAR A B， SUBRAMANIAN R B， THAKKAR S S， et al. Isolation， identification， and characterization of α-asarone， from hydromethanolic leaf extract of Acorus calamus L. and its apoptosis-inducing mechanism in A549 cells[J]. J Biomol Struct Dyn， 2024， 42（11）：5515-5535.

[20]" "陈晓华， 曹小龙， 张晓娜， 等. ALA-PDT对人食管癌Eca-109细胞相关凋亡蛋白表达的影响[J]. 山东医药， 2013， 53（17）：4-6.

[21]" "张彐宁， 靳晓飞， 高维娟. p53/CytC/Apaf-1介导线粒体凋亡通路对缺血性脑卒中的作用[J]. 中国老年学杂志， 2022， 42（1）：226-230.