蒙药当玛-5片剂对功能性消化不良模型小鼠肠道菌群的调节作用研究

【摘 要】 目的：探讨蒙药当玛-5片剂干预后功能性消化不良模型小鼠肠道菌群的结构及功能变化。方法：将小鼠随机分为正常组、模型组、蒙药当玛-5片剂组，采用隔日饮食加稀盐酸喂养的方法连续造模10d，第11天开始连续灌胃给药7d。第17天麻醉，收集粪便样本。扩增肠道菌群16S rRNA基因的V3+V4区，采用高通量测序分析门水平和属水平的物种组成和组间差异，进行功能基因预测分析。结果：给予蒙药当玛-5片剂可以增加功能性消化不良小鼠肠道菌群物种多样性及丰度。在门水平上，蒙药当玛-5片剂干预后厚壁菌门、放线菌门相对丰度减少，拟杆菌门、变形菌门相对丰度增加；在属水平上，蒙药当玛-5片剂干预后Veillonellaceae、Bacteroidaceae和Ruminococcaceae的丰度比模型组低1.47%、14.19%、1.61%，Lachnospiraceae的丰度比模型组高17.51%。COG分析示蒙药当玛-5片剂组差异较明显的信号通路有信号转导机制（signal transduction mechanisms）、细胞周期控制（cell cycle control）、未知功能（function unknown）、转录（transeription）、防御机制 （defense mechanisms）。KEGG分析：蒙药当玛-5片剂组差异较明显的途径有氨基酸代谢（amino acid metabolism）、global and verview maps、转录（translation）、膜转运（membrane transport）。结论：本研究结果表明，蒙药当玛-5片剂能调节失衡的菌群，并使之相对丰度恢复正常水平。

【关键词】 蒙药当玛-5片剂，功能性消化不良，肠道菌群

【中图分类号】R285.5

【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2024）20-0026-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.20.zgmzmjyyzz202420007

功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）是指具有餐后饱胀不适、早饱感、上腹痛、上腹烧灼感中的一项或多项的症状［1］。FD为临床常见病、多发病，病程长、易反复发作，不同程度地影响着患者的生活质量。FD的发病机制尚不明确，目前认为FD与胃肠动力障碍、内脏高敏感性、脑肠轴、遗传免疫等有关。肠道菌群作为“新起之秀”，被认为可以影响胃肠的感觉、动力及免疫功能［2］，有改变内脏敏感度、胃肠动力、影响消化吸收等作用，因此FD发生与肠道微生态有密切关系［3］。肠道菌群通过与宿主共代谢，调控肠道微生态的动态平衡，在维持人类健康中发挥重要的作用。一旦肠道内环境发生改变，肠道菌群出现失调，则会引发消化系统疾病、内分泌系统疾病、中枢神经系统疾病、代谢性疾病等［4］。蒙药当玛-5片剂是由石榴、红花、豆蔻、肉桂和荜茇等5味药组成，具有开欲消食、暖胃的功能，用于食欲不振、消化不良、胃脘冷痛、满闷嗳气、腹胀泄泻等病症。石榴可缓解炎症性肠病［5］；红花多糖对小鼠的肠道菌群失调具有调节作用［6］；豆蔻可促进胃肠蠕动，防止肠粘连［7］；肉桂改善小肠通透性，提高小肠屏蔽功能［8］；适当剂量的荜茇提取物通过促进大鼠肠道内有益菌属的增长、防止肠道粘膜屏障的破坏［9］。其单味药对胃肠功能、肠道菌群有一定的调节作用，所以本研究将蒙药当玛-5片剂给予FD模型小鼠后观察肠道菌群的变化，为进一步深入研究提供实验依据。

1 实验材料

SPF级KM小鼠（雄性）45只，购于北京国家动物中心；蒙药当玛-5片剂由奥特奇蒙药股份有限公司提供的中式成品。

2 实验方法

2.1 建立模型和药物干预 将小鼠随机分为3组，即正常组、模型组、蒙药当玛-5片剂组，每组15只。除正常组外，其余组均采用隔日饮食加稀盐酸喂养的方法造模。逢单日正常进食，逢双日禁食，自由饮水，水中加入盐酸（每升饮用水中加入10 mol/L 盐酸 10 mL）以破坏胃内酸碱平衡，连续10 d；正常组常规喂养。造模第11天开始蒙药当玛-5片剂组小鼠灌胃溶于蒸馏水的蒙药当玛-5片剂溶液，给药剂量为2.0 g/kg（浓度为0.2 g/mL），正常组和模型组给予蒸馏水，1次/日，连续给药7 d。第16天灌胃给药后，各组小鼠禁食不禁水24 h，之后乙醚麻醉动物，剑突下切口约2 cm打开腹腔，取结肠粪便，-80 ℃保存备用。

2.2 16S rDNA 扩增子测序（16S rDNA Amplicon Sequencing） 采用QIAamp快速DNA粪便迷你试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany），按说明书从解冻粪便样品中提取总DNA。然后进行16S rDNA 扩增子测序。测序得到原始数据（Raw Data），首先对原始数据进行拼接和过滤，排除实验及测序过程中带来的干扰和误差，使信息分析结果更加准确、可靠。之后对有效数据进行 OTUs（operational taxonomic units）聚类和物种注释分析。高变区及常用扩增引物信息如下：①338F-806R（V3-V4区）或515F-907R（V4-V5区）。②PCR 引物：515F∶[KG-*3/5]（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）and 806R∶[KG-*3/5]（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），使用具有 12 nt独特条形码的特异性引物扩增16S rRNA基因。

2.3 物种多样性和差异分析 在物种注释的基础上，通过稀疏曲线计算每组样本在门和属水平上的丰度柱形累加图；根据结果，选取每个样品在各分类水平上丰度排名前10的OTU，生成相对丰度柱形累加图，以观察各样品在不同分类水平上的丰度，比较三组的OTUs、微生物多样性和丰富度。在97%相似性的水平上对序列进行聚类（USEARCH，version 10.0），测序所有序列数时以0.005%作为阈值过滤 OUT［10］。

2.4 肠道菌群物种注释及功能预测 采用PICRUSt （phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states） 工具通过KEGG （kyoto encyclopedia of genes and genomes）代谢途径分析差异途径，通过COG（clusters of orthologous groups of proteins）分析蛋白功能分类。

2.5 统计分析 所有统计分析均采用SPSS17.0版本。使用Welch T检验比较组间的微生物门和属浓度。

3 结果

3.1 肠道菌群的结构与组成 应用PacBio SMRT测序技术对粪便样本中微生物进行了分析。40份粪便样本共获得3006612条高质量完整的16S rRNA基因序列，每个样品平均序列为75165条。根据序列的97％相似度水平划分操作分类单元后，共得到8178个具有代表性的OTUs。稀释曲线和香农指数曲线（如图1）结果显示，曲线随测序量增加而逐渐趋向平坦，各样本物种数量（Sobs）或多样性指数（Shannon）并不会随测序数量的增加而显著增多，说明测序深度已经基本覆盖到样品中的所有物种，获得数据可用于分析。正常组、模型组和蒙药当玛-5片剂组之间共同变化的益生菌有266个，其中上调189个，下调77个。

A.正常组；B.模型组；C.蒙药当玛-5片剂组

3.2 肠道菌群结构变化 所有样本共检测到11个细菌菌门，其中拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（proteobacteria）为主要成分，与正常组相比模型组的厚壁菌门/拟杆菌门比例升高，同时放线菌门（Actinobacteria）相对丰度增加。与模型组相比，蒙药当玛-5片剂组厚壁菌门、放线菌门相对丰度减少，拟杆菌门、变形菌门相对丰度增加。

氏球菌科（Veillonellaceae）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）等4个菌属的丰度占比达82.0%。模型组肠道中Veillonellaceae、Bacteroidaceae和Ruminococcaceae的丰度比蒙药当玛-5片剂组高1.47%、14.19%、1.61%，模型组肠道中Lachnospiraceae的丰度比蒙药当玛-5片剂组低17.51%。如图2所示。

3.3 肠道菌群的功能化分析 COG分析数据显示，与正常组相比，模型组的COG样本丰度显著增加，增加的细胞通路有辅酶转运和代谢（coenzyme transport and metabolism）、细胞壁（cell wall）、无机物的运输和代谢（inorganic in transport and metabolism）、信号转导（signal transduction）、细胞运动 （ cell motility）、仅通过基因功能预测（general function prediction only）。蒙药当玛-5片剂组差异较明显的信号通路有信号转导机制（signal transduction mechanisms）、细胞周期控制（cell cycle control）、未知功能（function unknown）、转录（transeription）、防御机制 （defense mechanisms）。

KEGG分析数据显示，模型组与正常组相比，有显著差异的细胞通路有氨基酸代谢（amino acid metabolism）、膜转运（membrane transport）、信号转导（signal traansduction）、细胞运动（cell motility）。蒙药当玛-5片剂组差异较明显的途径有氨基酸代谢（amino acid metabolism）、global and verview maps、转录（translation）、膜转运（membrane transport） 。如图3所示。

4 讨论

当前FD的治疗主要分为促动力和PPI抑酸，已有研究［4］发现长期使用PPI可能会导致小肠细菌过度生长，加重消化不良症状，而使用益生菌或不可吸收的肠道抗生素利福昔明能改善消化不良症状，因此若以肠道菌群作为新的研究切入点，将有助于探索FD新的防治方法。

本实验中通过16S rDNA 高通量测序发现，给予蒙药当玛-5片剂可增加 FD 大鼠肠道菌群物种多样性及丰度。厚壁菌门可以维持宿主的免疫系统稳态［11］。毛螺菌科将多糖转化成乙酸，含量过高就会损害肠道内壁，引发肠炎; 普氏菌属的含量过高易引起胃肠道疼痛反应［12-13］。胃瘤球菌可以抑制有害菌感染，能改善发育不良小鼠的生长及代谢异常［14-15］。在门水平上，FD 大鼠厚壁菌门/拟杆菌门比例升高，同时放线菌门（Actinobacteria）相对丰度增加；在属水平上，FD 大鼠Veillonellaceae、Bacteroidaceae和Ruminococcaceae的丰度增加，Lachnospiraceae丰度降低；蒙药当玛-5片剂可逆转这些菌群变化，表明蒙药当玛-5片剂可调节失衡的菌群并使之相对丰度恢复正常水平，从而发挥治疗作用。

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（收稿日期：2024-01-29 编辑：刘 斌）

基金项目：内蒙古自治区科技创新引导项目（No.KCBJ2018044）。

作者简介：好毕斯哈拉图（1977—），男，蒙古族，硕士，主任医师，研究方向为蒙医药学研究。E-mail：jnhbs@163.com