基因工程中PCR技术常考知识点的归纳与拓展

［摘 要］PCR技术是基因工程中获取和扩增目的基因的常用方法之一，其中常考查到的知识点有与引物相关的问题、酶切片段分析及变性、复性、延伸等环节的相关分析等。文章结合典型考题对这几个问题进行归纳分析。

［关键词］基因工程；PCR技术；常考知识点

［中图分类号］    G633.91        ［文献标识码］    A        ［文章编号］    1674-6058（2024）14-0080-04

【名师简介】曾凡洪，中学高级教师，武汉市学科带头人，曾担任高中生物奥赛主教练。先后在《生物学教学》《中学生物教学》《中学教学参考》《高中生学习》等报纸杂志上发表文章50余篇，并参与多本著作的编写。

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，其最大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大后进行比对，这也是“微量证据”的威力之所在。PCR的理论依据是DNA复制，一般的中学实验室很难具备相应的实验设备和操作条件，因此对于这块知识，基本上是以理论讲解为主。目前的一些考题涉及的PCR知识已经比较具体和深入了，具有一定的难度。本文结合典型考题对基因工程中PCR技术常考知识点进行归纳分析。

一、与引物相关的问题

引物是一小段单链DNA或RNA，是DNA复制的起始点。在引物的3＇—OH上，核苷酸以酯键形式进行加成，因此引物的3＇—OH必须是游离的。引物分为两种：存在于自然生物的DNA复制引物（RNA引物）和PCR中人工合成的引物（通常为DNA引物）。一般所说的引物是指DNA引物。PCR中的引物是人工合成的两段寡脱氧核苷酸序列。

（一）设计引物的基本要求

根据DNA复制原理和引物的作用，在设计引物时，要注意以下几个基本问题。

1. 引物自身不应存在互补序列

若引物自身存在互补序列，引物自身就会折叠成发卡结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。一般要求引物自身不能有连续4个碱基的互补。

2.引物与引物之间不应存在互补序列

两个引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3＇端的互补重叠，以防止引物二聚体的形成。一般要求引物之间不能有连续4个碱基的互补。

3.引物中G+C碱基应占一定的比例

G+C碱基含量尽量控制在40%到60%之间，解链温度（Tm值）最好贴近72 ℃，G+C碱基含量太低会导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于增强PCR的特异性；G+C碱基含量太高也易于引发非特异扩增。

4. 一对引物中G+C碱基占比最好基本相等

一对引物中G+C碱基占比基本相等可防止引物对在退火、延伸等环节反应差别太大。

（二）带有一个引物和带有一对引物的比例问题（放射性DNA含量的比例分析）

在设计引物时，若用放射性同位素标记，则产物中也会出现放射性，分为一条链带有放射性和两条链带有放射性两种情况，对应的是产物带有一个引物和带有一对引物。

（三）两条链等长的DNA分子最先出现在第几轮循环及所占的比例问题

引物结合到模板链上时，一般会从模板链的3＇端靠近内侧段结合上去，导致刚扩增产生的DNA分子两条链不等长。随着扩增轮数的增加，会逐渐出现两条链等长的DNA分子，且其比例会逐渐增加。

【典例1】（2011·江苏，第33题节选）请回答基因工程方面的有关问题：

（1）利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如图1所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。

①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为                     。

②在第              轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。

图1

解析：PCR扩增（或DNA复制）时，一对引物分别结合到两条模板链上，根据半保留复制的特点，只有1个DNA分子不含有引物A（含引物B），经过四轮循环，产生24（16）个DNA分子，含有引物A的DNA片段有15个。

DNA分子复制时，每次只有用上一轮新形成的DNA单链为模板，所合成的DNA分子的长度才会逐渐缩短，直到出现两条链等长的DNA分子为止。因此，可以用图2来表示DNA复制的轮数与DNA分子长度之间的关系：从上往下，上面的一条链是模板链，下面的一条链是新合成的子链，下一轮复制时始终是以下面这条链为模板所形成的DNA分子才是最短的，则经过第三轮复制后，出现了两条链等长的DNA分子。且以一条链为模板时，到第三轮就会出现1个两条链等长的DNA分子，因此，一个DNA分子经过第三轮循环后就会出现2个两条链等长的DNA分子，所占的比例为2/23=1/4。

图2

答案：15/16    三

（四）需要的引物数与循环次数之间的关系

PCR扩增过程中，循环了n次，则得到的DNA分子数为2n，脱氧核苷酸链数为2×2n，其中只有2条模板链不带有引物，则循环n次时，所需要的引物数为2×2n-2。

（五）引物末端修饰问题

在基因工程中，有时为方便构建重组质粒，在引物中需要增加恰当的限制酶切点，或为了显示目的基因所在位置、产生定向变异等，需要对引物进行适当的修饰。引物的5＇端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影响扩增的特异性；而引物的延伸是从3＇端开始的，该端不能进行任何修饰。引物的5＇端修饰包括加酶切位点、加标记荧光、引入蛋白质结合DNA序列、引入点突变、插入突变、缺失突变序列、引入启动子序列等。

【典例2】（2021·山东，第25题节选）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后， γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图3所示。

图3

（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图3可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是               ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是               。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要               种酶。

解析：此题具有一定的难度，首先应读懂题意。要在荧光蛋白基因前面插入γ基因上游不同长度的片段，并能使荧光蛋白表达，只能分别用MunⅠ和XhoⅠ来对荧光蛋白基因的前面部位进行切割，且根据F1～F7片段表达的方向（左→右）和荧光蛋白基因表达的方向（右→左），只能F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶与XhoⅠ产生的黏性末端相同，R末端添加的序列所对应的限制酶与MunⅠ产生的黏性末端相同，再根据图3中提供的五种限制酶识别序列及切割位点可知，与XhoⅠ产生相同的黏性末端的限制酶只能是[SalⅠ，]与MunⅠ产生相同的黏性末端的限制酶只能是EcoRⅠ。从产物扩增到载体构建完成的整个过程需要Taq DNA聚合酶、限制酶[SalⅠ、][EcoRⅠ、][XhoⅠ、][MunⅠ、]DNA连接酶共6种酶参与。

答案：SalⅠ EcoRⅠ 6

（六）引物结合位置的确定问题

为了获得符合要求的PCR产物，不仅要求引物设计合理，还应考虑引物与模板链的结合部位的恰当性。

【典例3】（2020·江苏，第33题节选）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图4（以EcoRⅠ酶切为例）：

图4

请据图回答问题：

（3）若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是                          （从引物①②③④中选择，填编号）。

[      DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）  已知

序列       [5＇-AACTATGCGCTCATGA……GCAATGCGTAGCCTCT-3＇][3＇-TTGATACGCGAGTACT……CGTTACGCATCGGAGA-5＇]     PCR

引物       ①5＇-AACTATGCGCTCATGA-3＇

②5＇-GCAATGCGTAGCCTCT-3＇

③5＇-AGAGGCTACGCATTGC-3＇

④5＇-TCATGAGCGCATAGTT-3＇    ]

解析：此题难度较大，根据碱基互补配对原则，引物①②③④结合到已知序列上的位置及延伸方向如下表所示（“→”方向表示延伸方向）：

[      DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）  已知

序列                                             ←④                                            ←③

[5＇-AACTATGCGCTCATGA……GCAATGCGTAGCCTCT-3＇][3＇-TTGATACGCGAGTACT……CGTTACGCATCGGAGA-5＇

]

①→                                             ②→

PCR

引物       ①5＇-AACTATGCGCTCATGA-3＇

②5＇-GCAATGCGTAGCCTCT-3＇

③5＇-AGAGGCTACGCATTGC-3＇

④5＇-TCATGAGCGCATAGTT-3＇    ]

分别以①②③④为引物合成的片段F如图5所示：

图5

以①（或③）为引物合成的片段F经DNA连接酶连接成的环状DNA如图6甲所示，以④（或②）为引物合成的片段F经DNA连接酶连接成的环状DNA如图6乙所示。

甲                          乙

图6

图6甲显示以①（或③）为引物扩增形成的环状DNA的末端为未知序列，再次扩增时，无法构建与之互补配对的引物，因而无法扩增出片段F的完整序列，而图6乙显示以④（或②）为引物扩增形成的环状DNA的起始端和末端均为已知序列，因此，可以根据已知序列来设计引物，从而扩增出片段F的完整序列。

答案：②④

（七）目的基因的长度控制

在PCR中，含有目的基因的片段的长度，也是由引物与模板链结合的位置来决定的。引物分别从两条模板链的3＇端结合上去，根据典例1解析中的图示，扩增到第三轮时出现了两条链等长的DNA片段，这也是最短的DNA片段。随着循环次数的增加，这样的DNA片段越来越多，当循环次数较多时，最终只有2个DNA片段的两条链不等长，其余均为两条链等长的DNA片段，而两条链等长的DNA片段的每条链的5＇端分别为引物A和引物B，即此DNA片段的长度是由一对引物与模板链结合的位置来决定的。

二、酶切片段分析

酶切片段分析涉及几种不同的限制酶在切割质粒时彼此之间相对位置的确定、酶切后所产生的片段长度等。

【典例4】图7是限制酶BamHⅠ与BglⅡ的识别序列及切割位点示意图；图8表示质粒pZHZ11（总长为3.8 kb，1 kb=1000对碱基）的结构，其中Apr为链霉素抗性基因；lacZ为蓝色显色基因（基因表达的产物将无色化合物X-gal转化为一种蓝色物质，菌落呈蓝色，否则为白色），请分析回答问题：

图7                                      图8

（1）图8中若将两端分别用限制酶BamHⅠ和BglⅡ切开的单个目的基因片段置换pZHZ11中0.5 kb的BamHⅠ酶切片段，形成4.9 kb的重组质粒，则目的基因的长度为                   kb。

（2）上述4.9 kb的重组质粒有两种形式，若用BamHⅠ和EcoRⅠ联合酶切其中一种，只能获得1.6 kb和3.3 kb两种DNA片段；那么用联合酶切同等长度的另一种重组质粒，则可获得                   kb和                   kb两种DNA片段。

解析：（1）质粒pZHZ11的总长为3.8 kb，将两端分别用限制酶BamHⅠ和BglⅡ切开的单个目的基因片段置换pZHZ11中0.5 kb的BamHⅠ酶切片段，形成4.9 kb的重组质粒，则目的基因的长度=4.9 kb-（3.8 kb-0.5 kb）=1.6 kb。

（2）BamHⅠ酶切产生的黏性末端为[-G           -CCTAG]和[GATCC-            G-]，BglⅡ酶切产生的黏性末端为[-A           -TCTAG]和[GATCT-           A-]，可见这两种限制酶切割DNA分子后，产生的黏性末端是相同的，DNA连接酶能将它们切割产生的DNA片段连接起来，但在连接处形成的DNA片段为[-GGATCT--CCTAGA-]，它不能再被限制酶BamHⅠ和BglⅡ识别和切割了。因此，重组质粒有两种类型：一种是目的基因被BamHⅠ酶切产生的黏性末端与图8质粒pZHZ11上右侧的BamHⅠ酶切产生的黏性末端相连接，另一种是目的基因被BamHⅠ酶切产生的黏性末端与图8质粒pZHZ11上左侧的BamHⅠ酶切产生的黏性末端相连接，分别形成图9和图10两种重组质粒。

图9

图10

答案：（1）1.6 （2）1.7 3.2

三、变性、复性、延伸等环节的相关分析

PCR反应过程的基本环节一般包括高温变性（90～95 ℃）→低温退火（复性）（55～60 ℃）→适温延伸（70～75 ℃）。一般要经历30多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。

（一）变性与预变性的目的及要求

PCR在进行循环之前，常常要进行一次预变性。预变性一般为95 ℃ ，1～9 min；变性一般为95 ℃，20～30 s。变性的目的是促使模板DNA分子的两条链打开成为两条单链，而预变性的目的也是增加大分子模板DNA彻底变性的概率。那可否直接在高温变性环节延长时间呢？很明显，不可以。如果在高温变性环节时间过长，会导致DNA聚合酶的活性降低甚至失活，而在预变性之后加入DNA聚合酶，然后再设置变性、复性、延伸的温度、时间及循环次数，就可避免这种影响。

（二）复性（退火）的目的及要求

复性，又称为退火，目的是当温度下降到55 ℃左右，使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。复性一般为55～60 ℃ ，20～40 s。

（三）延伸的目的及要求

延伸是指温度上升到70～75 ℃，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。延伸一般为72 ℃ ，5～15 min。很明显，延伸环节是所有环节中用时最长的，这样可以让DNA聚合酶有充分的时间来催化DNA的合成。延伸环节为何选用处于三个环节的中间温度72 ℃左右呢？其一，DNA聚合酶为耐高温的Taq DNA聚合酶，为了保证其活性，温度不能过低；其二，高温会导致引物与模板脱落，因此温度不能过高。而PCR在最后一步，往往被设置成4 ℃，目的是让DNA在从整个热循环仪中取出来之前保持稳定。

［   参   考   文   献   ］

［1］  任志鸿.十年高考分类解析与应试策略［M］.北京：知识出版社，2022.

［2］  任志鸿.十年高考分类解析与应试策略［M］.海南：南方出版社，2013.

［3］  杨建雄.分子生物学［M］.北京：化学化工出版社，2009.

（责任编辑 罗 艳）