栽培黄芩与其对照药材的HPLC指纹图谱及近红外图谱比较研究

赵建军高晓娟++王英华++马玲　王汉卿

[摘要] 黄芩为我国常用大宗中药材，其野生资源急剧减少，目前我国宁夏、河北、山西、甘肃等地大面积栽培，供中药材市场及临床应用。该研究旨在通过12批栽培黄芩药材和黄芩对照药材的HPLC指纹图谱及近红外图谱研究，对4个产区的栽培黄芩药材进行质量评价。结果显示，12批栽培黄芩药材与黄芩对照药材色谱指纹图谱和近红外图谱的相似度分别大于0.961和0.983，结合12批栽培黄芩药材与黄芩对照药材共有峰面积（近红外为对应点吸收值）的配对样本t检验，均无显著差异，验证了12批栽培黄芩药材与对照药材质量的一致性较高。该研究基于色谱指纹图谱与近红外图谱，并结合配对样本t检验对分析结果进行验证，避免了分析中因指纹图谱相似度阈值限定不明确而引起的误判，为分析结果提供了可靠的依据。同时，通过对综合性较强的2种检测手段的比较研究，为完善中药材质量控制方法提供了新的思路。

[关键词] 黄芩； 指纹图谱； 近红外； 化学成分； 质量控制

Comparative studies on HPLC fingerprint and nearinfrared spectra of

cultivated and reference crude Scutellaria baicalensis

ZHAO Jianjun1， GAO Xiaojuan1， WANG Yinghua1，3， MA Ling3， WANG Hanqing1，2*

（1. College of Pharmacy， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China；

2. Ningxia Research Center of Modern Hui Medicine Engineering and Technology， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China；

3. Ningxia Institute for Drug Control， Yinchuan 750004， China）

[Abstract] Scutellaria baicalensis is a common and important medicinal plant in China， facing with reducing sharply in wild resources. To meet the needs in Chinese herbwouls medicine market and clinical application， S. baicalensis has been widely cultivated in Ningxia， Hebei， Shanxi， and Gansu et al. HPLC fingerprint and nearinfrared were studied in the research to evaluate quality difference of S. baicalensis in four districts. The results showed that the similarity of HPLC fingerprint of 12 cultivated S. baicalensis and reference crude herb is more than 0.961， and the other is more than 0.983. On the other hand， paired sample ttest indicated there has no significant difference between the common peaks′ area of 12 cultivated S. baicalensis and reference crude herb. It was verified that 12 cultivated S. baicalensis has highly consistency with reference crude herb. On the basis of chromatographic fingerprint and nearinfrared spectrum， the study applied paired sample ttest to verify analysis results， which could avoid erroneous judgment induced by indefinite threshold values in the similarity of chromatographic fingerprint and provide reliable basis for the analysis results. Meanwhile， it also provides a new idea for improving the quality control method of Chinese medicinal materials by comparative study about two comprehensive detection means.

[Key words] Scutellaria baicalensis； fingerprint； nearinfrared spectra； chemical composition； quality control

doi：10.4268/cjcmm20162220

黄芩Scutellaria baicalensis Georgi为唇形科黄芩属多年生草本植物[1]，其根黄芩Scutellariae Radix 为大宗中药材，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎之功[2]。研究表明黄芩中黄芩素、黄芩苷等黄酮类成分是其主要药效成分[3]，具有抗炎、抗菌、抗氧化、镇痛、保肝等多种药理作用[45]。随着药理研究的深入，其药效价值不断得到开发，野生资源因此急剧减少，黄芩已列入Ⅲ级国家重点保护野生药材物种。为满足市场需求，自1958年以来，宁夏、河北、山西、甘肃等地开始大面积栽培[6]。影响中药材质量因素是复杂而多变的，如产地、采收期、规格、生长方式等。因此，为了全面的控制及评价中药材质量，引入指纹图谱的中药质量评价模式已成为国内外共识[7]。

色谱图谱具有重复性高、分离性能好、分析速度快、使用范围广等优点已被广泛用于中药指纹图谱的研究[89]。但其局限性也较为明显，任何与色谱相关实验条件的改变，都意味着整体色谱图形的变异，给中药材评价工作造成一定困难，与此同时指纹图谱的解析也是研究的一大难点，常用的相似度比较的方法虽然方便，但人为主观判断成分较多，缺乏相似度阈值的限定，缺乏评判的客观标准[10]。近红外光谱分析是一种快速、价廉、无损分析方法，适用于固体、液体等形态，可用于药物研发、生产等生产过程的质量监控。其与化学计量学结合，已被用于农业、食品、化学和石油化工等领域的定性和定量分析[11]。介于近红外光谱分析的优势，其方法对中药材质量的评价结果是否与指纹图谱方法的一致，相关研究还少有报道。

本研究采用HPLC测定12批不同产地栽培黄芩药材和1批黄芩对照药材中黄芩苷的含量并建立色谱指纹图谱。同时，基于近红外光谱分析技术建立黄芩药材的光谱指纹图谱，并对指纹图谱及近红外光谱进行比较分析，判断2种分析方法中，12批栽培黄芩与对照药材相比较的质量差异。

1 材料

高效液相色谱仪（Agilent 1260 LC色谱工作站，G1313A自动进样器，G1316A柱温箱，G1311A四元泵，G1379A脱气机，G1314A紫外检测器）；AE240电子分析天平（1/1万）；超声清洗机；Bruker MatrixF型傅利叶变换近红外光谱仪（测试条件：分辨率8 cm-1；样品累积扫描次数32 Scans；背景累积扫描次数32 Scans；光谱范围12 000～4 000 cm-1；软件为OPUS 5.5）。

黄芩苷对照品（批号110715200212，中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈为色谱纯；娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

实验所用的12批栽培黄芩药材采自于4个产区，经王英华主任药师鉴定为唇形科黄芩属植物黄芩S. baicalensis，样本信息见表1。黄芩对照药材来自于中国食品药品检定研究院。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱Phenomenex Gemini C18柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相甲醇乙腈醋酸、醋酸钠（pH 4.5）缓冲液，梯度洗脱程序见表2；流速1.0 mL·min-1；柱温25 ℃；检测波长276 nm；进样量10 μL。

2.2 色谱对照品溶液制备

精密称量黄芩苷对照品 0.016 06 g，置于10 mL的量瓶中，加适量色谱甲醇使溶解，定容至刻度，得黄芩苷对照品储备液。精密量取黄芩苷对照品储备液4 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成质量浓度为0.257 g·L-1的黄芩苷对照品溶液，备用。

2.3 色谱供试品溶液制备

黄芩药材粉碎，过80目筛，精密称取0.5 g，置100 mL量瓶中，加入70%甲醇100 mL，称重，室温超声提取45 min，静置，补足失重，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.4 色谱方法学考察

2.4.1 精密度试验 取13号对照药材供试品溶液，连续进样5次，以黄芩苷为标准峰，各主要色谱峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于5.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取13号对照药材粉末5份，每份0.5 g，按2.3项制备供试品溶液，按2.1项色谱条件进样检测。5次测得的各主要色谱峰峰面积和保留时间的RSD均小于5.0%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取13号对照药材供试品溶液，分别于放置0， 2， 4， 8， 12， 24 h，按2.1项色谱条件进样检测。测得各时间段的RSD均小于5.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 样品色谱测定

分别精密对照品和供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样检测，记录90 min色谱图，见图1。

2.6 样品近红外光谱测定

分别取烘干至恒重且过80目筛的黄芩药材粉末适量，在Bruker MatrixF型傅利叶变换近红外光谱仪扫描近红外光谱，测试条件：分辨率8 cm-1；样品累积扫描次数32 Scans；背景累积扫描次数32 Scans；光谱范围12 000～4 000 cm-1；软件为OPUS 5.5。每个样品平行测定6次，取平均值作为该样品的原始光谱，环境条件为温度23 ℃，湿度40%。

2.7 数据分析

2.7.1 指纹图谱相似度分析 采用中国药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价（A版），以对照药材色谱峰为参照峰，对12批黄芩药材和对照药材指纹图谱进行自动匹配，并对所有的HPLC指纹图谱全谱进行相似度计算，用相关系数表征相似度。

2.7.2 近红外特征谱段相关系数分析 采用OPUS软件对获取的各批次黄芩药材及对照药材的近红外光谱进行一阶导数+矢量归一化预处理，以对照药材近红外光谱为参考光谱，计算各批次黄芩药材测定光谱与参考光谱的相关系数，比较其与参考光谱的相似程度。

2.7.3 共有峰差异显著性分析 采用SPSS 19.0 中的配对样本t检验分别分析各栽培黄芩药材与黄芩对照药材的色谱指纹图谱和光谱指纹图谱共有峰吸收是否存在显著差异。

3 结果

3.1 黄芩苷含量测定

采用HPLC测定12批栽培黄芩药材和黄芩对照药材中黄芩苷含量数据，见表1。由表1可知，对照药材中黄芩苷含量高于其他各批次药材，但是，各批次药材中黄芩苷含量均高于2015年版药典规定的含量（9.0%），说明各产地栽培黄芩均可作为合格黄芩药材使用。

3.2 栽培黄芩色谱指纹图谱及相似度评价

12批黄芩药材和黄芩对照药材按2.1项制备供试品溶液后按2.3项色谱条件进行检测，记录90 min色谱图，建立了黄芩HPLC指纹图谱。色谱记录数据经Aligent工作站导出AIA.格式数据后输入中药色谱指纹图谱相似度评价软件中进行共有峰标定和相似度计算。以匹配数目为13的色谱峰为共有峰，共标定23个共有峰，见图2，各共有峰的保留时间和峰面积见表3。由表3可知，各共有峰保留时间的RSD均小于0.40%，说明该方法准确、可靠，可以用于黄芩药材的质量评价。以13号黄芩对照药材为参照谱图计算的相似度，1～12号样品与对照药材的相似度分别为0.980，0.961，0.984，0.989，0.987，0.983，0.989，0.995，0.995，0.974，0.990，0.983。由相似度计算结果可知，用于建立指 纹图谱的12批栽培黄芩药材和黄芩对照药材相似度较高（0.961～0.995），说明各产地栽培黄芩与对照药材的一致度较高。

3.3 栽培黄芩共有峰面积与黄芩对照药材共有峰面积差异分析

依据表3中各样品共有峰面积值，12批栽培黄芩的共有峰面积值分别与黄芩对照药材共有峰面积进行配对样本t检验，检验结果见表4。由表4可知，各批次栽培黄芩药材的共有峰面积与对照药材共有峰面积无显著差异。

3.4 栽培黄芩近红外光谱分析

获取的12批栽培黄芩药材及黄芩对照药材的近红外原始光谱见图3。近红外光谱常受到光程、样品厚度、基线漂移等因素的影响，在分析之前需要对其进行预处理。矢量归一化可以消除光程或样品厚度的影响，而导数化可以消除基线漂移等因素的影响，本研究采用一阶导数+矢量归一化对各批栽培黄芩药材近红外图谱进行预处理，预处理后图谱见图4。对预处理后的近红外图谱利用OPUS 5.5软件，以对照药材图谱为参照谱图，计算1～12号栽培黄芩近红外图谱与黄芩对照药材图谱的相似度结果分别为0.991， 0.989， 0.983， 0.993， 0.993， 0.991， 0.990， 0.995， 0.994， 0.995， 0.992，

0.990。由相似度计算可知，各批次栽培黄芩药材与黄芩对照药材的近红外光谱相似度较高（0.983～0.995），说明各产地栽培黄芩与对照药材在近红外光谱分析层面上的一致度较高。

3.5 栽培黄芩药材与黄芩对照药材近红外吸收差异

利用OPUS软件对各批近红外光谱进行一阶导数和矢量归一化预处理后导出各点吸收数据，分别将12批栽培黄芩药材的近红外吸收数据与黄芩药材的吸收数据进行配对样本t检验，检验结果见表5。由表5可知，各批次栽培黄芩药材的近红外吸收与对照药材近红外吸收无显著差异。

4 讨论

常用中药指纹图谱研究的方法与技术包含广泛，如薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法、近红外光谱法、X射线衍射法及核磁共振法等。其中液相色谱法是最常用的指纹图谱研究方法。但其不足之处也较为明显[12]，如对中药这样一个复杂体系，同时解决分离与检测两大问题，单一的分离与检测模式容易丢失大量信息；其次由于实验条件的微小改动就会显著的影响实验结果，对重现性有较大挑战，这也是众多研究黄芩指纹图谱的文章当中，色谱图有较大差异的原因之一。近年来，近红外光谱技术较多的应用于中药的鉴别和定性、定量的分析中。其方法快速、方便、准确、非侵入式分析、易于实现生产过程的在线控制等优点[13]。但也有其方法的局限性，如：近红外光谱较差的特征性，导致分析技术对化学计量学极其依赖；作为相对分析技术，数学模型的建立需要传统分析方法辅助等[14]。

本研究分别采用HPLC指纹图谱和近红外光谱对4个产区12批栽培黄芩药材与其对照药材的差异进行研究，结果表明：色谱指纹图谱与近红外光谱相似度表征中，12批栽培黄芩药材与其对照药材的相似度均较高（均大于0.96）。虽然相似度均较高，但由于相似度没有客观的阈值限定，为确保所得结论的可靠性，同时采用12批栽培黄芩药材指纹图谱共有峰面积（近红外为各点吸收值）与黄芩对照药材的共有峰面积（近红外为各点吸收值）进行配对样本t检验比较其差异，结果表明12批黄芩栽培药材均与黄芩对照药材的吸收无显著差异，与相似度结果一致。色谱指纹图谱、近红外光谱及配对样本t检验的综合方法相互验证，为最终所得结果12批栽培黄芩药材与黄芩对照药材品质无显著差异，作为合格药材使用提供了可靠的分析依据。

本研究首次同时用色谱指纹图谱和近红外光谱分析栽培黄芩与其对照药材的质量差异，并结合配对样本t检验对分析结果进行验证。一方面避免了分析中因指纹图谱相似度无阈值而引起的误判；另一方面通过多种分析的相互验证，为分析结果提供了可靠的依据，同时，为完善中药材质量控制方法提供了新的思路。

上述实验结果提出了新的思考方向，HPLC指纹图谱与近红外光谱的一致性问题是否在某些中药材原料中，近红外光谱可以对HPLC指纹图谱进行补充或替代，从而在鉴定中药材原料符合我国药典质量标准的基础上，采用更加经济与环境友好的实验方法，还需要进一步研究。

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[责任编辑 丁广治]