高表达miRNA-9-5p的骨髓间充质干细胞对呼吸机引起的肺损伤大鼠的影响及机制研究

林新 余天兴 许俊平 陈丽芳 谢万 包宇旺

【摘要】 目的 研究具有高表达miRNA-9-5p的骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）对呼吸机引起的肺损伤（ventilator-induced lung injury，VILI）大鼠的影响以及机制。方法 建立机械通气的肺损伤模型，通过慢病毒转染构建高miRNA-9-5p表达的BMSCs，评估BMSCs和高miRNA-9-5p表达的BMSCs对VILI大鼠的影响。通过蛋白质印迹和qRT-PCR方法检测BMSCs和高表达miRNA-9-5p的BMSCs对VILI大鼠肺部的LC3、Atg5和Atg7表达的影响。结果 移植BMSCs可显著降低VILI大鼠肺部损伤的严重程度以及支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage，BAL）中的IL-1β和IL-2水平。移植高表达miRNA-9-5p的BMSCs能显著降低VILI大鼠的肺部损伤严重程度和BAL液中的IL-1β和IL-2水平。与VILI大鼠相比，移植的BMSCs明显增加了自噬相关蛋白的表达，包括Atg5和Atg7。与对照组相比，移植高表达miRNA-9-5p的BMSCs可显著提高VILI大鼠的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例以及Atg5和Atg7水平。结论 BMSCs可能通过上调miRNA-9-5p表达提高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例、Atg5和Atg7介导的自噬水平，进而缓解VILI。

【关键词】 BMSCs；VILI；miRNA-9-5p；自噬

文章编号：1672-1721（2024）16-0001-05     文献标志码：A     中国图书分类号：R563

危重病人的机械通气不可避免诱发病理性和生理性的VILI，其特点是肺血管通透性增加、炎症细胞浸润和血液凝固[1]。确定有效的促进肺损伤修复的保护性通气策略，将推动机械通气治疗发展。BMSCs是具有自我复制能力的多功能、多潜能的细胞，可在培养基中增殖并多样化形成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。BMSCs在体外具有强大的增殖能力。有研究表明，移植BMSCs可治疗一些疾病，包括肺部损伤[2]。有文献报道，BMSCs可加速大鼠VILI的恢复[3]。BMSCs恢复VILI的机制还需进一步探索。因此，本研究探讨BMSCs和具有高表达miRNA-9-5p的BMSCs对VILI大鼠的影响及可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

（1）动物。SPF级雄性SD大鼠60只[常州卡文斯实验动物有限公司，SCXK（豫）2005-0001]，年龄6～8周。随机分为5组，即正常组、VILI组、VILI+BMSC组、VILI+BMSC+LV-NC（NC）组和VILI+BMSC+LV-miRNA -9-5p（OE）组，每组12只。（2）BMSCs的分离和培养。从大鼠后肢解剖股骨和胫骨，切开末端暴露骨髓腔。将骨髓分散在DMEM中，以1 500 r/min离心5 min。将骨髓颗粒重新悬浮在含有10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，在37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养。24 h后更换培养基，培养贴壁的细胞，每2 d更换培养基。当细胞达到70%～80%汇合时，用质量分数0.25%的胰蛋白酶消化，传代。取4代的BMSCs用于慢病毒感染。

1.2 方法

（1）慢病毒感染法构建高表达miRNA-9-5p的

BMSCs。阴性对照慢病毒（LV-NC）、携带miRNA-9-5p的慢病毒（LV-miRNA-9-5p）用于感染BMSCs。72 h观察绿色荧光。得到稳定感染的BMSCs（OE）和BMSCs（NC），用于随后的大鼠体内移植实验。（2）肺部损伤模型的建立。为建立机械通气的肺部损伤模型，5%水合氯醛麻醉后，大鼠被固定成仰卧位。使用小型动物呼吸机（DW3000，淮北正华生物仪器设备有限公司）通气4 h，潮气量为40 mL/kg。为防止过度通气，呼吸频率调整为15次/min。实验得到了福建医科大学实验动物中心动物伦理委员会的批准。（3）标本的采集和处理。模型建立的第7天，抽取动脉血测量氧气和二氧化碳的分压。每组取6只大鼠的肺部进行称重，在80 ℃的烘箱中干燥72 h，然后再次称重，计算肺部湿/干（W/D）比率。采用改良方法[4]从其余大鼠身上获得BAL，于-80 ℃冰箱保存，后续用于测定促炎症细胞因子的含量。右上肺组织在室温下用4%多聚甲醛缓冲液固定24 h，然后石蜡包埋并切片进行组织学评价。右下肺组织冷冻在液氮中，保存于-80 ℃冰箱，进行蛋白质印迹分析（western blot，WB）。（4）酶联免疫吸附试验（ELISA）。使用ELISA试剂盒IL-1β和IL-2（ABclonal Technology）测定促炎症细胞因子的水平。（5）苏木精-伊红染色。石蜡切片在室温下用二甲苯脱蜡2次。乙醇处理后用自来水清洗2 min。用苏木精染色5 min，自来水清洗，在1%酸性酒精中分化，在1%氨水中变蓝，伊红染色1 min，并再次用自来水清洗。然后用乙醇进行脱水，在二甲苯中清洗2次，持续10 min，用中性胶固定。显微镜观察。（6）RNA提取和定量实时PCR（qRT-PCR）分析。用RNA提取试剂盒（TransGen Biotech）从肺部分离出总RNA。根据反转录试剂盒（TransGen Biotech）的说明，以总RNA为模板，反转录成cDNA，作为qRT-PCR的模板。引物见表1。（7）WB法测定LC3、Atg7和Atg5的表达。从肺部切片中提取总蛋白，用BCA试剂盒定量检测蛋白水平。20～30 μg的蛋白质使用SDS-PAGE电泳分离，然后转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，在室温下用牛血清白蛋白溶液封闭1 h。然后将PVDF膜与一抗在4 ℃下静置孵育过夜。洗膜后，与相应的HRP结合的二抗进行孵育。使用ECL化学发光试剂盒显影。使用Image J软件定量分析。

1.3 统计分析

使用SPSS 25.0统计学软件分析数据，计量资料以x±s表示，2组比较采用t检验，多组比较采用方差分析（ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs对VILI大鼠的影响

图1（a）中，与正常组相比，VILI组的肺部W/D比率明显增加（P<0.05）；正常组和VILI+BMSC组的的肺部W/D比率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。图1（b）中，VILI+BMSC组的氧分压高于VILI组（P<0.05），但低于正常组（P<0.05）。图1（c）中，VILI组BAL液中IL-1β和IL-2的水平明显高于正常组（P<0.05），VILI+BMSC组IL-1β和IL-2的水平明显低于VILI组（P<0.05），说明炎症的发展受到了一定程度的抑制。大鼠肺组织的组织学评价结果见图2。正常组没有肺泡巨噬细胞浸润，没有明显的病理变化。VILI组的肺组织有明显的病理变化，肺泡间隔增厚，部分肺泡腔内有血性渗出。移植BMSCs后，肺组织的病理变化得到了改善。这些结果表明，BMSCs对VILI大鼠肺损伤有改善作用。

2.2 BMSCs对LC3、Atg5和Atg7介导的自噬的影响

WB法检测LC3、Atg5和Atg7的蛋白表达，见图3（a）。与正常/VILI组相比，VILI+BMSC组Atg5和Atg7蛋白的相对表达明显增加（P<0.05），见图3（b）。VILI组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的比例明显低于正常组和VILI+BMSC组，见图3（c）。上述结果表明，BMSCs的移植可能会增加VILI大鼠的自噬。本研究通过qRT-PCR检测了大鼠肺部LC3、Atg5和Atg7的mRNA水平。与蛋白质水平类似，与正常组和VILI组相比，VILI+BMSC组大鼠肺部LC3、Atg5和Atg7的水平都有所增加，见图3（d）。本研究还检测了miRNA-9-5p的mRNA表达，见图3（e）。与正常组和VILI组相比，VILI+BMSC组miRNA-9-5p的mRNA表达明显增加（P<0.05）。由此可见，LC3、Atg5和Atg7在大鼠肺部的表达与BMSCs的移植有关，高miRNA-9-5p表达的BMSCs可能对VILI大鼠有积极作用。

2.3 miRNA-9-5p高表达的BMSCs对VILI大鼠的影响

为了探索miRNA-9-5p对VILI大鼠的影响，经qRT-PCR检测成功建立高表达miRNA-9-5p的BMSCs，见图4（a）。qRT-PCR检测也显示，用高表达miRNA-9-5p的BMSCs治疗的大鼠肺组织中miRNA-9-5p的表达高于NC组，见图4（b）。虽然NC组和OE组的肺部W/D比率比较，差异无统计学意义（P>0.05），但OE组的肺部W/D比率有下降趋势，见图4（c）。OE组的氧分压高于NC组（P<0.05），见图4（d）。OE组BAL液中IL-1β和IL-2的水平明显低于NC组（P<0.05），见图4（e）。OE组部分肺泡腔内的肺组织有明显的病理变化，见图5，表明高miRNA-9-5p表达的BMSCs可在一定程度上改善VILI大鼠肺泡腔内的肺泡间隔增厚。上述研究结果表明，高表达miRNA-9-5p的BMSCs可能有助于改善VILI大鼠的肺部损伤。

2.4 miRNA-9-5p高表达的BMSCs对由LC3、Atg5和Atg7介导的自噬的影响

OE组的LC3、Atg5和Atg7的mRNA、蛋白表达与NC组相比明显升高（P<0.05），见图6（a）、图6（b）和图6（d）。OE组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例明显高于NC组（P<0.05），见图6（c）。由此可见，LC3、Atg5和Atg7在肺部的mRNA和蛋白质的表达与miRNA-9-5p的含量有关。BMSCs可能通过VILI大鼠的miRNA-9-5p的表达来调节LC3、Atg5和Atg7的表达，并介导自噬。

3 讨论

VILI是指在治疗过程中由机械通气引起或加重的急性肺损伤，是呼吸支持患者不可避免的严重并发症。据报道，BMSCs可以增强VILI大鼠肺损伤的恢复，然而其基本机制仍不清楚。本研究探讨了miRNA-9-5p高表达的BMSCs对VILI大鼠的影响以及它们是否通过自噬发挥作用。结果发现，BMSCs可能通过上调miRNA-9-5p、增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率、Atg5和Atg7介导的自噬水平缓解VILI。这也是首次报道miRNA-9-5p高表达的BMSCs对VILI大鼠自噬的影响。

BMSCs已被广泛用于创伤、炎症损伤修复、抗感染和免疫调节等实验，在肺损伤领域的基础研究和临床实践中受到越来越多的关注[5]。有研究表明，BMSCs可以分化和修复受损的肺泡上皮细胞和毛细血管膜，降低其通透性，还可促进血管生成素-1的分泌，预防结构损伤、肺水肿[6]。本研究中，移植BMSCs后，大鼠肺部W/D比率降低，氧分压明显改善，IL-1β和IL-2水平降低，肺泡腔内出血渗出程度明显减轻，提示移植BMSCs可明显减轻VILI大鼠的肺部损伤。

自噬作为程序性细胞死亡，在体内发生氧化应激或内质网应激时可维持细胞的平衡。许多研究证实，自噬的激活可在一定程度上促进先天免疫反应和炎症反应的发生。自噬反应由一系列的自噬相关蛋白介导。Atg5和Atg7是上游自噬信号的关键蛋白，可帮助细胞减轻压力，抵抗细胞毒性，并促进细胞生存[7]。LC3Ⅱ是一种重要的自噬体膜标志蛋白，由细胞质LC3（LC3Ⅰ）转化而来，LC3通过使用各种自噬相关蛋白来调节自噬反应[8]。本研究结果显示，移植BMSCs后，VILI大鼠肺部Atg5和Atg7的水平以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例明显增加，表明移植BMSCs减轻VILI大鼠肺部损伤与自噬有关。

有研究报道，miRNA-9可以通过激活自噬来促进BMSCs分化为神经元细胞[9]。在许多病理状态下，miRNA-9-5p是血管生成的一个重要调节因素。本研究中，移植高表达miRNA-9-5p的BMSCs组明显减轻了VILI大鼠的肺部损伤，表明BMSCs可能通过上调miRNA-9-5p的表达缓解机械通气引起的肺部损伤。与NC组相比，移植高表达miRNA-9-5p的BMSCs还能显著提高VILI大鼠的Atg5和Atg7水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例。这些结果表明，BMSCs可能通过上调miRNA-9-5p表达、增加LC3、Atg5和Atg7介导的自噬减轻VILI引起的肺损伤。然而本研究不够深入，未来还需要在动物和临床上进行更深层次的研究。

综上所述，移植BMSCs可明显减轻呼吸机诱发的大鼠肺损伤，BMSCs可通过上调miRNA-9-5p表达、增加LC3、Atg5和Atg7介导的自噬缓解VILI。

参考文献

[1] 刘帅，章利铭.围手术期呼吸机诱导的肺损伤研究进展（英文）[J].中南大学学报（医学版），2019，44（4）：346-353.

[2] 乔广明，王志敏，张雪欣，等.重组人粒细胞刺激因子促进骨髓间充质干细胞修复急性肺损伤的机制研究[J].解放军医药杂志，2021，33（11）：1-4.

[3] CURLEY G F，HAYES M，ANSARI B，et al.Mesenchymal stem cells enhance recovery and repair following ventilator-induced lung injury in the rat[J].Thorax，2012，67（6）：496-501.

[4] LI Q，GE Y L，LI M，et al.miR-127 contributes to ventilator-induced lung injury[J].Mol Med Rep，2017，16（4）：4119-4126.

[5] 瞿海龙，周英莲，张新欣，等.间充质干细胞介导的肺损伤修复多重效应[J].医学研究与教育，2017，34（4）：46-51.

[6] REN G，ZHANG L Y，ZHAO X，et al.Mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression occurs via concerted action of chemokines and nitric oxide[J].Cell Stem Cell，2008，2（2）：141-150.

[7] 张丰，柴克霞.Atg5和Atg7在自身免疫性疾病中的研究进展[J].现代临床医学，2019，45（6）：455-457，469.

[8] TANIDA I，UENO T，KOMINAMI E.LC3 and autophagy[J].Methods Mol Biol，2008，445：77-88.

[9] 徐玉生，王培松，马玉斐，等.miRNA-9修饰骨髓间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤的实验研究[J].中华神经医学杂志，2012，11（12）：1204-1208.