葛花总黄酮通过调控miR-155-5p对高糖诱导的内皮细胞损伤的影响

张莉 崔洋洋 张萍 陈璐

摘要  目的：探讨葛花总黄酮对高糖诱导内皮细胞损伤的影响及其可能的作用机制。方法：采用高糖诱导人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）建立细胞损伤模型，葛花总黄酮处理高糖诱导的HUVECs；利用试剂盒检测丙二醛（MDA）水平和超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性；流式细胞术检测细胞凋亡率；实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）法检测miR-155-5p的mRNA表达量；anti-miR-NC、anti-miR-155-5p分别转染至HUVECs后加入含有30 mmol/L葡萄糖处理24 h，miR-NC、miR-155-5p mimics分别转染至HUVECs后加入含有100 mg/L葛花总黄酮与30 mmol/L葡萄糖处理24 h，采用上述方法分别检测细胞凋亡率、MDA的水平和SOD、GSH-Px的活性；Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白表达水平用蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）法进行检测。结果：葛花总黄酮处理后，高糖诱导的HUVECs中MDA水平、凋亡蛋白Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9表达和凋亡率下降（P＜0.05），miR-155-5p表达量降低（P＜0.05），SOD、GSH-Px活性升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性；转染anti-miR-155-5p后，MDA水平、凋亡蛋白Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9表达、凋亡率、SOD、GSH-Px的活性呈现出葛花总黄酮处理组相同的趋势（P＜0.05）；转染miR-155-5p mimics可减弱葛花总黄酮对高糖诱导的HUVECs氧化应激及凋亡的作用。结论：葛花总黄酮可以抑制miR-155-5p表达，减轻细胞氧化损伤和凋亡，减轻高糖引起的内皮细胞损伤。

关键词  葛花总黄酮；人脐静脉血管内皮细胞；miR-155-5p；氧化应激；细胞凋亡

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.11.009

糖尿病血管并发症是常见的一种疾病类型，我国糖尿病发病率逐年上升，体内血糖水平持续升高可导致糖尿病血管并发症的发生［1-2］。高糖可损伤血管内皮细胞［3-4］，因此，减轻血管内皮细胞损伤将有助于减缓糖尿病血管病变的发展进程。葛花是豆科植物野葛的花，研究表明葛花总黄酮对大鼠局灶性脑缺血再灌注模型具有显著的保护作用，其作用机制与抑制炎性因子有关［5］。但葛花总黄酮对高糖诱导的内皮细胞损伤影响尚未可知。微小RNA（miRNA）属于单链小RNA分子，其可通过阻止靶基因的翻译及表达从而发挥作用，有研究指出，神经细胞损伤可上调miR-155-5p表达，抑制其表达可减轻OGD/R诱导的神经细胞

引用信息  张莉，崔洋洋，张萍，等.葛花总黄酮通过调控miR-155-5p对高糖诱导的内皮细胞损伤的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（11）：1975-1980.

损伤［6］。miR-155-5p在高糖环境下的表达及作用研究较少。本研究将人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）暴露于高糖环境，探讨葛花总黄酮是否通过调控miR-155-5p的表达影响高糖诱导的内皮细胞损伤。

1  材料与方法

1.1  材料与试剂

葛花购自西安汇林生物科技有限公司；HUVECs购自上海弘顺生物科技有限公司；实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）试剂盒购自北京天根生化；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；一抗Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9及其二抗均购自美国CST。

1.2  方法

1.2.1  制备葛花总黄酮

精确称量5 g葛花粗粉，分别加入30%、50%、70%、90%乙醇，超声提取时间分别为40、60、80、100 min，提取2次后过滤，收集滤液后减压回收至得到葛

花提取物，将葛花提取物放置在25 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶解定容后测量总黄酮含量（5.16%），加入二甲基亚砜（DMSO）溶解葛花总黄酮，稀释浓度至10、30、100 mg/L［7］。

1.2.2  实验分组

HUVECs接种于6孔板（1×105个/孔），加入含有30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养HUVECs 24 h［8］，作为HG组。加入含有5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养HUVECs 24 h，作为Con组。加入含有不同浓度葛花总黄酮（10、30、100 mg/L）与30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养HUVECs 24 h，分别作为HG＋葛花总黄酮-低组、HG＋葛花总黄酮-中组、HG＋葛花总黄酮-高组。采用anti-miR-NC、anti-miR-155-5p、miR-NC、miR-155-5p mimics分别转染至HUVECs，转染成功后加入含有30 mmol/L葡萄糖的DMEM，或加入含有100 mg/L葛花总黄酮与30 mmol/L葡萄糖的DMEM，培养HUVECs 24 h，分别作为HG＋anti-miR-NC组、HG＋anti-miR-155-5p组、HG＋葛花总黄酮＋miR-NC组、HG＋葛花总黄酮＋miR-155-5p组。

1.2.3  检测MDA水平和SOD、GSH-Px活性

收集各组HUVECs，按照对应指标的试剂盒说明书操作，利用酶标仪在对应检测波长下检测MDA、SOD、GSH-Px水平。

1.2.4  流式细胞仪检测细胞凋亡

收集各组HUVECs，严格按照试剂盒说明，采用人膜联蛋白V-异硫氨酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）双染色法，避光孵育10 min，应用流式细胞仪检测待检。

1.2.5  测定miR-155-5p水平

收集各组HUVECs加入裂解溶液后室温孵育5 min，3 000 r/min转速离心5 min后依次分别加入氯仿、异丙醇，弃上清，加入1 mL 75%乙醇，充分洗涤RNA沉淀，离心后弃上清得到RNA。反转录合成cDNA，取1 μL与10 μL SYBR Green Master Mix、0.8 μL正反向引物和ddH2O（补足体系）配制20 μL的qRT-PCR反应体系，应用美国ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪在95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s（循环40次）的反应条件下，检测miR-155-5p基因表达。

1.2.6  蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）法检测凋亡蛋白表达

收集HUVECs细胞，加入裂解液提取总蛋白，测定浓度，电泳、转膜、封闭等步骤完成后，加入一抗Cleaved-Caspase 3（1∶1 000）、Cleaved-Caspase 9（1∶1 000），内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，1∶3 000），4 ℃孵育12 h，加入二抗（1∶5 000），孵育2 h，增强型化学发光（ECL）显影，以蛋白条带灰度值计算蛋白表达量。

1.3  统计学处理

采用SPSS 26.0软件进行统计分析，符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，两两比较采取t检验，单因素方差分析用于多组间比较，进一步两两比较采用SNK-q检验。以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结  果

2.1  葛花总黄酮对高糖诱导的内皮细胞氧化应激的影响

与Con组比较，HG组MDA水平升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px的活性降低（P＜0.05）；与HG组比较，HG＋葛花总黄酮-低组、HG＋葛花总黄酮-中组、HG＋葛花总黄酮-高组MDA水平降低（P＜0.05），SOD、GSH-Px的活性升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性。详见表1。

2.2  葛花总黄酮对高糖诱导的内皮细胞凋亡的影响

与Con组比较，HG组内皮细胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9和凋亡率水平上升（P＜0.05）；与HG组比较，HG＋葛花总黄酮-低组、HG＋葛花总黄酮-中组、HG＋葛花总黄酮-高组细胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9和凋亡率水平下降（P＜0.05），且呈剂量依赖性。详见表2及图1。

2.3  葛花总黄酮对高糖诱导的内皮细胞miR-155-5p表达的影响

HG组miR-155-5p的表达量较Con组升高（P＜0.05）；HG＋葛花总黄酮-低组、HG＋葛花总黄酮-中组、HG＋葛花总黄酮-高组miR-155-5p的表达量较HG组降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性。详见表3。

2.4  干扰miR-155-5p表达对高糖诱导的内皮细胞损伤的影响

HG＋anti-miR-155-5p组MDA水平较HG＋anti-miR-NC组下降（P＜0.05），SOD、GSH-Px活性增强（P＜0.001），细胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白和凋亡率水平下降（P＜0.05）。详见图2、图3及表4。

2.5  上调miR-155-5p表达逆转葛花总黄酮（100 mg/L）对高糖诱导的内皮细胞损伤的作用

与HG＋葛花总黄酮＋miR-NC组比较，HG＋葛花总黄酮＋miR-155-5p组MDA升高，SOD、GSH-Px活性下降（P＜0.001）；细胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白和凋亡率水平升高（P＜0.001）。详见图3及表5。

3  讨  论

血管内皮细胞损伤或功能障碍是糖尿病血管并发症的主要病理改变，随着疾病恶化可加重心血管疾病的发生，高糖可促进血管内皮细胞凋亡及氧化应激的发生从而加重细胞损伤，研究表明，中医药具有抗氧化、抗炎等作用从而减缓糖尿病血管并发症的发展［9］。miRNA在高糖诱导的血管内皮细胞损伤中表达异常，有作为糖尿病血管并发症治疗靶点的潜力［10-11］。但miRNA是否可作为中医药治疗糖尿病血管并发症的潜在靶点尚未阐明。

葛花总黄酮是葛花的主要活性成分之一，其具有清除活性氧的能力，还具有抗氧自由基的作用，研究表明，葛花总黄酮可抑制炎症细胞因子浸润及细胞凋亡从而减轻心肌缺血再灌注损伤［12］。葛花总黄酮可通过增强大鼠视网膜抗氧化能力从而减缓糖尿病视网膜病变的发展进程［13］。但葛花总黄酮与糖尿病血管并发症相关性研究鲜有报道。本研究结果显示，高糖诱导的内皮细胞MDA水平上升，SOD、GSH-Px活性下降，与之前的文献研究结果［14］相近，葛花总黄酮处理后MDA水平降低，SOD、GSH-Px活性升高，且呈剂量依赖性，提示葛花总黄酮可引导高糖引起的内皮细胞氧化平衡。本研究结果显示，高糖诱导的内皮细胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9和凋亡率水平升高，与相关文献报道结果［15］相似，葛花总黄酮能够以浓度依赖性方式降低细胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平，提示葛花总黄酮可抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡。

miR-155-5p在草酸及一水草酸钙（COM）诱导的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）损伤中表达上调，干扰其表达可抑制COM诱导的HK-2细胞氧化损伤［16］。在缺氧复氧损伤的心肌细胞中，miR-155-5p表达增加，干扰miR-155-5p可缓解心肌细胞缺氧复氧损伤［17］。抑制miR-155-5p表达可抑制氧化应激及炎性，减缓高糖诱导疾病的发生发展［18］。本研究结果显示，HG组miR-155-5p的表达上调，葛花总黄酮可使miR-155-5p表达下调，提示葛花总黄酮减轻高糖诱导的内皮细胞损伤的途径可能通过下调miR-155-5p表达来实现。本研究结果显示，抑制miR-155-5p表达可增强细胞抗氧化能力及抑制细胞凋亡，而miR-155-5p过表达后，葛花总黄酮抑制高糖诱导的内皮细胞氧化应激和凋亡作用消失。提示葛花总黄酮通过抑制miR-155-5p的表达而减缓糖尿病血管并发症的发展进程。

综上所述，高糖诱导的内皮细胞中miR-155-5p表达水平升高，葛花总黄酮可抑制miR-155-5p的表达，减轻高糖引起的内皮细胞氧化损伤和凋亡，进而减轻细胞损伤，认为miR-155-5p有作为葛花总黄酮减轻高糖诱导的内皮细胞损伤治疗靶点的潜力。

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（收稿日期：2022-09-28）

（本文编辑王雅洁）