CLMS观察iRoot BP Plus对根尖倒充填封闭效果的体外研究

李莎 杜丽娟 薛蕾 王铭磊 万娜 冯明

[摘要]目的：觀察iRoot BP Plus作为根尖倒充填材料封闭根尖的效果。方法：选取上下颌单直根管离体牙60颗，Reciproc blue机用单支镍钛锉预备根管，热牙胶连续波技术充填根管，超声工作尖对离体牙根尖区行倒预备。将离体牙随机分为三组，分别以iRoot BP Plus、MTA、3MZ350树脂行倒充填。体式激光共聚焦扫描显微镜观察倒充填后材料及牙体组织的颜色变化率。上述标本再次随机分为两个亚组，分别浸泡于2%亚甲基蓝溶液和1 g/L罗丹明B荧光染料中，48 h后分别在光学显微镜、扫描电镜和激光共聚焦显微镜下测量染料线性渗漏长度；测量材料与牙本质间的微间隙宽度，观察不同倒充填材料与根管壁间的微观结合形态；计算分析根尖区微渗漏荧光染色面积。通过定性和定量的方法研究不同倒充填材料对根尖封闭性能的影响。结果：iRoot BP Plus组倒充填后未发生明显颜色改变，美观性优于MTA组（P＜0.05），但与树脂组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。iRoot BP Plus组染料渗漏长度较MTA组短（P＜0.05），和MTA组染料渗漏长度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。三组微间隙宽度比较，iRoot BP Plus组＜MTA组＜树脂组（P＜0.05）。三组微渗漏荧光染色面积比较，iRoot BP Plus组＜MTA组＜树脂组（P＜0.05）。结论：iRoot BP Plus具有良好的根尖封闭性、密合性和美观性。

[关键词]iRoot BP Plus；根尖倒充填；激光共聚焦扫描显微镜；扫描电子显微镜；体外研究

[中图分类号]R781.05    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2024）06-0056-04

In Vitro Research Concerning CLMS Observation of the Effect of  iRoot BP Plus on Root Tip Retrograde Filling and Sealing

LI Sha， DU Lijuan， XUE Lei， WANG Minglei， WAN Na， FENG Ming

（Dpartment of Dental and Endodontics Ⅱ， Urumqi Stomatological Hospital， Urumqi 830000， Xinjiang，China）

Abstract： Objective To observe how iRoot BP Plus， an apical filling material， sealed the apical root. Methods  Sixty in vitro teeth with a single straight root canal in upper and lower jaws were selected. A RECIPROC blue single nickel titaniμm file for instrμment was used for root-end preparation. The continuous wave of condensation technique with thermoplasticized gutta-percha was used to obturate roots. An ultrasonic tip was used to prepare the root end in vitro. The in vitro teeth were randomly divided into three groups， which were retrograde filled with iRoot BP Plus， MTA and resin（3MZ350）respectively. A dental microscope observed the color change rate of materials and dental tissue after the retrograde filling. The above specimens were again randomly divided into two sub -groups， and soaked in 2% methylene blue solution and 1g /L rhodamine solution respectively. Forty-eight hours later， the linear leakage length of dyes and the width of micro space between the materials and Dentin were measured under an optical microscope， a scanning electronic microscope and a laser confocal microscope. The microscopical bonding between different filling materials and root canal wall was observed. The microleakage fluorescent dyeing area of the root tip area was calculated and analyzed. The effect of different filling materials on apical sealing performance was studied through qualitative and quantitative methods. Results  There was no obvious color change after backfilling in iRoot BP Plus group， which was better than that in MTA group （P＜0.05）， but there was no significant difference between iRoot BP Plus group and resin group （P＞0.05）. The dye leakage length of iRoot BP Plus group was shorter than that of MTA group （P＜0.05）， and there was no significant difference in dye leakage length between iRoot BP Plus group and MTA group （P＞0.05）. The microgap width of the three groups was compared， iRoot BP Plus group＜MTA group＜resin group （P＜0.05）. The staining area of the three groups was compared， iRoot BP Plus group＜MTA group＜resin group （P＜0.05）. Conclusion  iRoot BP Plus is good in root tip sealing， combining and looking.

Key words： iRoot BP Plus; retrograde filling; confocal laser scanning microscope; scanning electron microscope; research in vitro

显微根尖外科手术是现阶段治疗难治性根尖炎、根尖囊肿的最好治疗方法，但依然存在失败案例[1-2]。术中根尖倒充填材料与根管壁之间不密合，感染未控制是导致手术失败直接原因[3-4]。根尖封闭质量是决定手术成功的重要因素，故选择合适高效的根尖倒充填材料在手术中变得尤为重要。iRoot BP Plus作为一种新兴生物陶瓷材料已逐渐应用于根尖手术，但术后疗效评估标准和观察期等方面均存在差异，远期疗效尚待追踪观察。目前，国内关于iRoot BP Plus的体外研究局限于描述性定性分析。故本实验不仅采用显微镜、扫描电镜定性描述，还采用激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）量化观察iRoot BP Plus倒充填后离体牙的根尖封闭性和密合性，为进一步保留天然牙，维护患牙美观提供参考依据。

1  材料和方法

1.1 离体牙收集：挑选60颗近期因牙周病或正畸减数拔除的下颌第二前磨牙、上下颌切牙和上颌尖牙，要求单直根管，根尖发育完整、牙根无龋坏、未做过牙髓治疗，根管顺畅，无根管内外吸收，无裂纹，无钙化。截冠后用刮治器和刀片清除牙根表面残留的牙石及软组织，在生理盐水中室温下保存备用。

1.2 材料与设备：iRoot BP Plus（创新生物公司，加拿大）；MTA、牙胶尖、cc+锉、AH plus（Dentsply公司，美国）；3MZ350树脂（3M公司，美国）；reciproc blue单支镍钛锉、5.25%次氯酸钠溶液、热牙胶胶囊、17%EDTA（VDW公司，德国）；TR21（MANI公司，日本）；垂直加压器（豪孚迪，美国）；藻酸盐印膜材（贺利氏古莎，德国）；P5超声根管治疗仪、P14D超声尖、碧蓝糊剂（艾龙公司，德国）；亚甲基蓝溶液（索莱宝公司，中国）；罗丹明B荧光染液（Sigama公司，美国）；手术显微镜（zunmax，中国）；扫描电镜（JSM-6390LV，日本）；激光共聚焦扫描显微镜（TCS-SP2，德国）。

1.3 方法

1.3.1 根管预备+根管充填：全部牙齿标本都由一名经过规范化培训的口腔专业型研究生进行根管预备根管充填。开髓后，用10#cc+锉测量工作长度，reciproc blue25#单支镍钛锉行根管预备，5.25%次氯酸钠溶液+17%EDTA行根管冲洗。AH plus根管封闭剂+热牙胶胶囊连续波技术充填根管，最后使用光固化复合树脂封闭根管口。X线片檢查根管充填状况，确保样本均充填致密。置于蒸馏水中保存。

1.3.2 根管倒预备+根管倒充填：全部牙齿标本均由一名经过规范化培训的主治医师处理。金刚砂车针TR21垂直于牙根长轴切除根尖约3 mm，P14D超声尖行倒预备，洞深3 mm。使用吸潮纸尖干燥根管，将样本随机分为iRoot BP Plus组、MTA组、3MZ350树脂组，每组20个。使用垂直加压器行倒充填后置于湿润藻酸盐硬膜材中保存7 d，使用高倍光学显微镜观察根尖横断面材料及周围牙本质颜色变化。

1.3.3 染色、观察、测量：待倒充填材料完化硬固后，将每组再次随机分为两个亚组，牙根表面涂布指甲油，只暴露根尖横截面，其中一亚组置于2%亚甲基蓝溶液中染色，浸泡2 d。用金刚砂车针TF21将牙根沿牙最长纵轴方向劈开，16倍手术显微镜下联合Digimizer软件测量渗漏值长度。同时使用扫描电镜观察材料与根管壁结合形态，测量倒充填材料与牙本质间微缝隙宽度。另一亚组置于1 g/L罗丹明B荧光染液中染色，浸泡2 d。激光共聚焦显微镜观察根尖区域微渗漏荧光染色情况，同时使用LEICA TCS SP5分析软件对荧光面积进行测量分析。

1.4 统计学分析：使用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。计数资料以例（%）表示，采用χ2检验。检验水准α=0.05，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2  结果

2.1 体式显微镜下观察：7 d后倒充填材料与牙体组织的颜色变化率结果显示，MTA组根尖横截面材料及周围牙本质均成淡灰色，颜色变化率为100%；iRoot BP Plus组所有样本均未出现颜色变化，颜色变化率为0%；树脂组所有样本均未出现颜色变化，变化率为0%（见图1）。三组美观性比较：iRoot BP Plus组在颜色稳定性、美观性方面优于MTA组，差异有统计学意义（P＜0.05），与树脂组差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 光学显微镜下观测根尖区染料渗透结果：牙根纵向劈开后，光学显微镜下观察到iRoot BP Plus组与对照组均有不同程度的染料渗透（见图2）。本实验运用Digimizer软件对牙根断面至倒充填材料间染料渗透最长距离进行测量，染料渗透长度越短说明该材料的封闭性越好。iRoot BP Plus组染料渗透平均长度为（1.06±0.28）mm，MTA组为（1.12±0.35）mm，树脂组染料渗透平均长度为（3.54±0.72）mm。统计学分析显示：iRoot BP Plus组和MTA组比较差异无统计学意义（P＞0.05），与树脂组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。iRoot BP Plus组和MTA组封闭性能优于树脂组。

2.3 扫描电镜观察倒充填材料与根管壁结合界面形态：在100倍镜下观察到iRoot BP Plus、MTA与牙本质结合较为紧密，未见明显缝隙，树脂组可见较为清晰缝隙。在1 000倍和5 000倍镜下观察到iRoot BP Plus在牙本质边界处形成较小的突起类似伪足，依附嵌入牙本质间隙，结合较好；MTA在牙本质边界处以断层形式形成类似云朵状不规则结晶体，与牙本质间断结合；树脂与牙本质边界形成巨大鸿沟，各自边界清晰，未见明显结合。见图3。在5000倍镜下，用扫描电镜分析标尺对倒充填材料与牙本质间最宽缝隙进行距离测量（如绿色箭头所示），iRoot BP Plus组为（1.24±0.72）μm，MTA组为（3.58±1.26）μm，树脂组为（11.58±3.18）μm，三组间两两比较均差异有统计学意义（P＜0.05）。iRoot BP Plus组与牙本质间缝隙最小，边缘结合性最好，密合性明显优于MTA组与树脂组。

2.4 激光共聚焦显微镜观测根尖荧光染料渗透结果：CLSM下可见iRoot BP Plus组、MTA组、树脂组根尖区域均有不同程度的荧光染色（见图4）。同时使用LEICA TCS SP5分析软件对图像进行荧光面积测量，iRoot BP Plus组为（4.78±1.32）μm2，MTA组为（9.32±4.17）μm2，树脂组为（27.45±7.19）μm2，三组间两两比较均差异有统计学意义（P＜0.05）。iRoot BP Plus组荧光渗透面积最小，密合性明显优于MTA组与树脂组。

3  讨论

3.1 研究iRoot BP Plus对根尖倒充填封闭效果的必要性：iRoot BP Plus是我国近5年出现的一种新型生物陶瓷材料。它的主要成分包括硅酸钙、氧化锆、磷酸钙、氢氧化钙和填料等[5]。在iRoot BP Plus出现前，MTA被广大临床医生和学者定义为显微根尖外科手术倒充填材料的金标准。大量实验研究证明了MTA具有良好的生物相容性和根尖封闭性［6］，无细胞毒性，且具有促进软组织再生、诱导骨细胞增殖作用［7］。但MTA固化时间长，操作效率低，价格昂贵，有潜在变色等缺点，并且在倒充填初期受根尖周组织液的浸泡、冲刷，易造成流失[8]。近年来有研究结果表明，iRoot BP Plus硬固时间短，抗冲刷能力强，与MTA理化性能相当，甚至较MTA具有更好的生物相容性和封闭性[9]。也有学者报道，认为iRoot BP Plus的封闭性能较MTA差[10]。目前关于这两种材料封闭性能综合性比较研究较少且结论不一。

3.2 研究结果的创新性讨论：体式显微镜下观察到iRoot BP Plus不易使牙体组织变色，性能更稳定，为维护患牙预后美观提供理论基础。这与iRoot BP Plus成分中不含引起牙变色的铝和氧化铋有关。而MTA及周围牙本质均变为灰黑色，提示MTA预后可能会引起牙齿渐进性变色，不宜用于治疗前牙。亚甲基蓝染料渗透实验显示iRoot BP Plus组和MTA组封闭性能优于树脂组，这与谢克贤等[14]研究的结果一致。扫描电镜观测结果显示，iRoot BP Plus与根管壁间微缝隙宽度小于MTA，这可能与其成分具有更小粒径有关。罗丹明渗透实验显示，iRoot BP Plus组根尖区荧光染色面积小于MTA和树脂组，且定量分析具有统计学意义。这与本实验在体式显微镜下观察到的亚甲基蓝渗透实验结果有差别，提示可能与选用的染料分子大小性能不同有关。罗丹明B为低分子染料，且具有荧光性，可以渗透到根尖区细菌及蛋白质无法渗透的部位，实验精确度更高，参考性更强。

3.3 本實验方法学的先进性：方法学中目前公认的微渗漏检测方法有葡萄糖氧化酶蒽酮法[11]、微生物渗漏法、放射性核素渗透法[12]，以及染料线性渗漏法[13]等。其中，染料渗漏法是牙体微渗漏检测中最为经典直观的方法之一[14]，且本实验采用的亚甲基蓝和罗丹明B染料，均为分子级别颗粒，如果染料无法渗入，那么较大直径的细菌和毒性代谢产物更加无法渗入。

渗透实验传统利用光学显微镜和扫描电镜进行描述性观察和定性研究，本实验通过激光共聚焦显微镜结合图像软件计算根尖区微渗漏荧光染色面积，以定量的方法研究不同倒充填材料对根尖封闭性能的影响，更科学准确地评价根尖封闭能力，使结果更具客观性，弥补了国内激光共聚焦显微镜定量分析倒充填材料封闭效果研究这一空白。激光共聚焦显微镜突破了光学显微镜不能对组织内部进行定量检测的限制，弥补了电镜在宏观和动态实时研究等方面的不足，克服了制样困难等方面的缺点。同时，CLMS也可运用于口腔其他方面的研究。

3.4 新型生物陶瓷材料的未来展望：本次体外实验得出的结果是iRoot BP Plus具有良好的根尖封闭性和密合性，与牙本质结合面的边缘适应性能优于MTA，且iRoot BP Plus不宜使自身及牙体变色，凝固时间短，抗冲刷能力强，无需调制，随取随用，临床操作效率高，价格低于MTA，有望替代MTA成为方便操作且性能优良的根尖倒充填材料。国内有学者[15-16]对iRoot BP Plus在临床中作为倒充填材料的疗效进行研究，结果显示，1年治愈率达95%，疗效优于MTA，并能有效减轻术中术后局部红肿、疼痛，控制根尖周病的病情，短期临床疗效较好。

目前关于新型倒充填材料封闭性能的研究大多为体外实验，临床实验及样本量均很少，其远期效果和临床应用还需进一步研究及随访。故本课题组后续将开展大样本随机临床对照实验研究，为临床疗效进行客观评价。

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[收稿日期]2022-12-27

本文引用格式：李莎，杜丽娟，薛蕾，等.CLMS观察iRoot BP Plus对根尖倒充填封闭效果的体外研究[J].中国美容医学，2024，33（6）：56-59.