miR-130a-5p靶向Runx2对牙槽骨成骨细胞增殖和分化的影响及其调控机制研究

张义林 侯旭 汪莉 朗么磋 李相宜

[摘要]目的：探究miR-130a-5p靶向Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）对牙槽骨成骨细胞（Alveolar osteoblast，AOB）增殖、凋亡、成骨分化的影響及其机制。方法：将AOB分为NC组、miR-NC组、miR-130a-5p组、miR-130a-5p+Runx2组和miR-130a-5p+SHH组。双荧光素酶报告验证miR-130a-5p对Runx2、Sonic hedgehog（SHH）的调控关系；CCK-8及EdU染色检测细胞增殖能力；AnnexinV-FITC/PI法检测细胞凋亡能力；ALP染色、茜素红染色检测细胞成骨分化能力；RT-qPCR检测miR-130a-5p、Runx2、SHH、神经胶质瘤关联癌基因同源物1（Gli1）mRNA水平；Western Blot检测增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Ki67、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（Osteocalcin，OCN）、骨形态发生蛋白2（Bone morphogenetic protein 2，BMP2）、Runx2、SHH、Gil1水平。结果：miR-130a-5p靶向调控Runx2、SHH。过表达miR-130a-5p后，细胞24 h、48 h、72 h OD值及EdU阳性率降低，细胞凋亡率升高，成骨分化能力降低，miR-130a-5p、Bax蛋白水平升高，Runx2、PCNA、Ki67、Bcl-2、ALP、OCN、BMP2蛋白及SHH、Gil1 mRNA和蛋白水平均降低（P＜0.05）。过表达miR-130a-5p和Runx2或过表达miR-130a-5p和SHH可减弱过表达miR-130a-5p对细胞增殖、凋亡、成骨分化的影响。结论：miR-130a-5p靶向Runx2抑制AOB增殖和成骨分化，并促进AOB凋亡，其可能通过抑制SHH信号通路发挥作用。

[关键词]miR-130a-5p；Runt相关转录因子2；牙槽骨成骨细胞；Sonic hedgehog信号通路；增殖；分化；调控机制

[中图分类号]R783.1    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2024）06-0051-05

Effects of miR-130a-5p Targeting Runx2 on the Proliferation and Differentiation of Alveolar Bone Osteoblasts and Its Regulatory Mechanism

ZHANG Yilin， HOU Xu， WANG Li， LANG Mecuo， LI Xiangyi

（ Department of Stomatology， West China Airport Hospital， Sichuan University， Chengdu Shuangliu First People's Hospital， Chengdu 610200， Sichuan， China ）

Abstract： Objective  To explore the effect of miR-130a-5p on proliferation， apoptosis and osteogenic differentiation of alveolar bone osteoblasts and its mechanism by targeting Runx2. Methods  AOB was divided into NC group， miR-NC group， miR-130a-5p group， miR-130a-5p+Runx2 group and miR-130a-5p+SHH group. The double luciferase report was used to verify the regulatory relationship of miR-130a-5p on Runx2 and SHH; CCK-8 and EdU staining were used to detect proliferation ability; Annexin V-FITC/PI method was used to detect apoptosis ability. ALP staining and alizarin red staining were used to detect the osteogenic differentiation ability. RT-qPCR was used to detect miR-130a-5p， Runx2， SHH and Gil1 mRNA levels. Western blot was used to detect PCNA， Ki67， Bcl-2， Bax， ALP， OCN， BMP2， Runx2， SHH， Gli1 protein levels. Results  MiR-130a-5p targeted Runx2 and SHH. After overexpression of miR-130a-5p， OD value at 24 h， 48 h and 72 h and EdU positive rate of cells were decreased， and apoptosis rate was increased. The osteogenic differentiation ability was decreased， miR-130a-5p and Bax protein levels were increased， and Runx2， PCNA， Ki67， Bcl-2， ALP， OCN， BMP2 protein levels， SHH， Gil1 mRNA and protein levels were decreased （P＜0.05）. Overexpression of miR-130a-5p and Runx2 or overexpression of miR-130a-5p and SHH could attenuate the effect of overexpression of miR-130a-5p on proliferation， apoptosis and osteogenic differentiation ability. Conclusion  MiR-130a-5p inhibits AOB proliferation and osteogenic differentiation， and promoted AOB apoptosis by targeting Runx2， which may play a role by inhibiting Sonic hedgehog signal pathway.

Key words： miR-130a-5p; Runt-related transcription factor 2; alveolar bone osteoblast; Sonic hedgehog signal pathway; proliferation; differentiation; regulatory mechanism

牙周疾病是常見的口腔疾病，能够引起由牙周组织（如牙龈、牙槽骨）缺损导致的牙齿缺失，甚至严重危害口腔健康，而牙周组织缺损又会造成牙齿修复和种植困难[1]。牙槽骨是牙齿修复的基础，成骨细胞是骨形成的主要细胞[2]。因此AOB的增殖、凋亡及成骨分化对牙槽骨的骨形成具有重要意义。微小RNA（miRNA）通过负调控靶mRNA的表达参与成骨细胞的增殖、凋亡及成骨分化等多种生物学过程[3]。一些研究表明miR-130a的异常表达与成骨分化有关[4]。如老年骨折患者血清中miR-130a表达升高，低表达miR-130a通过提高Runx2水平促进骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的成骨分化[5]。抑制miR-130a-3p水平能够促进骨关节炎软骨细胞的增殖和分化[6]。降低miR-130a-5p水平能够改善因产前地塞米松暴露引起的后代大鼠的成骨分化障碍[7]。Runx2是Runx家族成员，能够调控成骨相关基因表达和成骨细胞的增殖和分化，在骨形成和发育中起重要作用[8]。SHH信号通路在骨组织发育及细胞定向分化中扮演重要角色。研究发现Sonic hedgehog信号通路能够促进成骨细胞和MSCs的成骨分化[9]。如敲除SHH能够抑制BMSCs的成骨分化[10]。miR-874通过激活SHH信号通路提高骨质疏松症大鼠BMP2、Runx2、ALP、PCNA、Bcl-2水平，降低Bax水平，从而促进骨质疏松症大鼠成骨细胞的增殖和分化[11]。通过生物信息学分析，发现miR-130a-5p和Runx2、SHH间均存在结合位点。然而miR-130a-5p是否通过调控Runx2及SHH信号通路影响AOB增殖、凋亡及成骨分化尚不清楚。因此本研究拟探究miR-130a-5p靶向Runx2对AOB增殖、凋亡、成骨分化的影响及其机制，以期为牙槽骨缺损治疗提供新的策略。

1  材料和方法

1.1 材料

1.1.1 AOB样本来源：样本采集对象为四川大学华西空港医院口腔科就诊患者。纳入标准：①阻生牙、正畸拔除牙者；②无牙周、根尖病变及牙槽骨吸收；③未患骨代谢疾病者；④未服用影响骨代谢药物者。患者均自愿提供牙槽骨标本。本研究经过四川大学华西空港医院伦理委员会批准（20210213）。标本采集：取牙槽窝内壁少量牙槽骨，置于含1%青链霉素的低糖DMEM培养液中保存备用。

1.1.2 主要试剂和仪器：胎牛血清（美国Gibco公司）；DMEM培养基（美国Hyclone公司）；CCK-8试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；ALP（上海翊圣生物科技有限公司）；过表达慢病毒质粒pHRi-miR-130a-5p及其阴性对照（pHRi-miR-NC）（上海吉玛制药技术有限公司）；PCNA、Ki67、OCN、SHH、神经胶质瘤关联癌基因同源物1（Glioma associated oncogene homolog 1，Gli1）抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；CO2培养箱（美国Thermo公司）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；倒置显微镜（日本Olympus公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；蛋白电泳仪、转膜仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 AOB的培养和鉴定：取牙槽骨组织，经PBS溶液冲洗，剪碎（体积为1 mm3），胰蛋白酶、Ⅰ型/Ⅱ型胶原酶消化，离心收集骨粒。用含10%胎牛血清的DMEM培养基接种骨粒，置于37℃ 5%CO2培养箱中培养，每隔72 h换液一次，当密度达到80%时，胰蛋白酶消化传代，用反复贴壁法进行纯化，取第3代AOB进行实验。ALP染色：取第3代AOB常规培养，待细胞爬满玻片时，加入ALP固定液孵育3 min，ALP孵育液孵育20 min，光学显微镜（100×）下观察染色情况。茜素红染色：取第3代AOB常规培养，待细胞爬满玻片时，加入Genmed固定液孵育10 min，加入Genmed染色液孵育至橙红色，光学显微镜（100×）下观察染色情况。

1.2.2 细胞转染与分组：将AOB分为NC组（不转染）、miR-NC组（转染pHRi-miR-NC）、miR-130a-5p组（转染pHRi-miR-130a-5p）、miR-130a-5p+Runx2组（转染pHRi-miR-130a-5p和pHRi-Runx2）、miR-130a-5p+SHH组（转染pHRi-miR-130a-5p和pHRi-SHH）。根据LipofectamineTM3000说明书，将质粒和Lipofectamine 3000混合溶液加入AOB细胞。转染4 h后更换培养基，24 h后通过RT-qPCR检测是否转染成功。

1.2.3 靶基因预测及双荧光素酶实验：使用Target Scan数据库预测miR-130a-5p和Runx2、SHH的结合位点，分别构建野生型质粒psi-CHECK-Runx2-WT、psi-CHECK-SHH-WT和突变型质粒psi-CHECK-Runx2-MUT、psi-CHECK-SHH-MUT。利用LipofectamineTM3000分别将两种质粒与miR-130a-5p mimic及miR-NC mimic混合物转染至AOB细胞，转染48 h后检测荧光素酶活性。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖能力：将各组AOB细胞培养24 h、48 h、72 h后，将原培养液更换成含有10% CCK-8溶液的新鲜培养基。并置于37℃下孵育1 h。检测样品在450 nm处的吸光度。

1.2.5 ALP染色、茜素红染色检测细胞成骨分化能力：取各组AOB细胞，利用ALP染色、茜素红染色检测细胞成骨分化能力，方法同1.2.1。

1.2.6 RT-qPCR检测细胞miR-130a-5p、Runx2、SHH、Gil1 mRNA水平：采用Trizol试剂从AOB细胞中提取总RNA并反转录为cDNA，使用SYBR Green法进行扩增，U6、GAPDH作内参。使用2－ΔΔCT公式计算miR-130a-5p、Runx2、SHH、Gil1 mRNA相对表达水平。

1.2.7 Western Blot检测细胞PCNA、Ki67、Bcl-2、Bax、ALP、OCN、BMP2、Runx2、SHH、Gil1水平：取各组AOB胞，提取、测定并分离蛋白，转至PVDF膜，用脱脂牛奶封闭2 h，分别加入PCNA、Ki67、Bcl-2、Bax、ALP、OCN、BMP2、Runx2、SHH、Gil1一抗（1∶2 000）4℃过夜，二抗（1∶10 000）4℃孵育2 h，ECL显色剂显色，凝胶成像仪拍照，分析各组蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析：使用SPSS 16.0软件对数据进行分析。计量数据以（x?±s）表示，多组间比较使用单因素方差分析，多组间两两比较使用LSD-t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2  结果

2.1 AOB形态观察和鉴定：P3代AOB形态呈三角形或梭形，形态逐渐一致。ALP染色显示AOB产生蓝紫色染色结节。茜素红染色显示AOB产生橙红色钙化结节。说明分离培养的细胞为AOB。

2.2 miR-130a-5p靶向调控Runx2：Target Scan结果显示，miR-130a-5p与Runx2存在结合位点。荧光素酶报告基因实验显示，与miR-NC组相比，miR-130a-5p组野生型Runx2荧光素酶活性明显降低（P＜0.05），而突变型Runx2荧光素酶活性没有明显变化（P＞0.05）。RT-qPCR和Western blot结果显示，与miR-NC组相比，miR-130a-5p组miR-130a-5p水平明显升高，Runx2 mRNA和蛋白水平明显降低（P＜0.05）；与miR-130a-5p组相比，miR-130a-5p+Runx2组和miR-130a-5p+SHH组miR-130a-5p水平明显降低，Runx2 mRNA和蛋白水平明显升高（P＜0.05）。

2.3 miR-130a-5p靶向Runx2对AOB增殖的影响：CCK-8和Western blot结果显示，与miR-NC组相比，miR-130a-5p组细胞24 h、48 h、72 h OD值及PCNA、Ki67蛋白水平明显降低（P＜0.05）；与miR-130a-5p组相比，miR-130a-5p+Runx2组和miR-130a-5p+SHH组细胞24 h、48 h、72 h OD值及PCNA、Ki67蛋白水平明显升高（P＜0.05）。

2.4 miR-130a-5p靶向Runx2对AOB凋亡的影响：Western blot结果显示，与miR-NC组相比，miR-130a-5p组细胞Bax蛋白水平明显升高，Bcl-2蛋白水平明显降低（P＜0.05）；与miR-130a-5p组相比，miR-130a-5p+Runx2组和miR-130a-5p+SHH组Bax蛋白水平明显降低，Bcl-2蛋白水平明显升高（P＜0.05）。

2.5 miR-130a-5p靶向Runx2对AOB成骨分化的影响：ALP染色和茜素红染色结果显示，与miR-NC组相比，miR-130a-5p组细胞蓝紫色结节和橙红色结节明显减少，ALP、OCN、BMP2蛋白水平明显降低（P＜0.05）；与miR-130a-5p组相比，miR-130a-5p+Runx2组和miR-130a-5p+SHH组细胞蓝紫色结节和橙红色结节明显增加，ALP、OCN、BMP2蛋白水平明显升高（P＜0.05）。

2.6 miR-130a-5p抑制Sonic hedgehog信号通路：Target Scan结果显示，miR-130a-5p与SHH存在结合位点。荧光素酶报告基因实验显示，与miR-NC组相比，miR-130a-5p组野生型SHH荧光素酶活性明显降低（P＜0.05），而突变型SHH荧光素酶活性没有明显变化（P＞0.05）。RT-qPCR和Western blot结果显示，与miR-NC组相比，miR-130a-5p组SHH、Gil1 mRNA和蛋白水平明显降低（P＜0.05）；与miR-130a-5p组相比，miR-130a-5p+Runx2组和miR-130a-5p+SHH组SHH、Gil1 mRNA和蛋白水平明显升高（P＜0.05）。

3  讨论

越来越多的证据表明miRNA在成骨细胞的增殖、凋亡及成骨分化等多种生物学过程发挥重要作用[12]。研究发现，在骨关节炎软骨细胞中，miR-130a-3p水平明显升高，抑制miR-130a-3p水平能够促进骨关节炎软骨细胞的增殖和分化[13]。在骨质疏松症小鼠BMSCs中，miR-130a水平明显升高，抑制miR-130a水平能够促进BMSCs的成骨分化并降低其成脂分化[14]。然而miR-130a-5p对AOB影响研究较少。本研究构建了过表达miR-130a-5p的AOB细胞模型，发现在细胞增殖和凋亡方面，与miR-NC组相比，过表达miR-130a-5p后，細胞24 h、48 h、72 h OD值及EdU阳性率明显降低，细胞凋亡率明显升高，PCNA、Ki67、Bcl-2蛋白水平明显降低，Bax蛋白水平明显升高。说明过表达miR-130a-5p能够抑制AOB增殖，并促进其凋亡。在成骨分化方面，ALP是成骨分化早期标志物，能够促进AOB矿化，直接反映成骨细胞的活性和功能情况。OCN是成骨分化晚期标志物，能够反映成骨细胞的活性和保持骨的转化速率。BMP2不仅能够促进AOB分化，而且还能通过诱导AOB分泌OCN促进AOB矿化。本研究ALP染色和茜素红染色结果显示，过表达miR-130a-5p能够抑制AOB细胞蓝紫色结节和橙红色结节产生，抑制ALP、OCN、BMP2蛋白表达，说明miR-130a-5p能够抑制AOB各阶段的成骨分化。