补骨脂异黄酮通过miR-497-5p调控对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和迁移的机制研究

梁博 李国东 牟江月崔昭

[摘要]目的：探讨补骨脂异黄酮通过调控miR-497-5p抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和迁移的机制研究。方法：体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞，使用浓度为0、9、18、36μg/ml补骨脂异黄酮处理细胞，记为Con组、低剂量组、中剂量组、高剂量组；按照脂质体法miR-NC、miR-497-5p转染细胞，记为miR-NC组、miR-497-5p组；按照脂质体法anti-miR-NC、anti-miR-497-5p转染细胞后，使用36μg/ml补骨脂异黄酮处理细胞，记为高剂量组+anti-miR-NC组、高剂量组+anti-miR-497-5p组。CCK8、克隆实验检测细胞增殖；伤口愈合实验检测细胞迁移；Western blot实验检测Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表达水平；qRT-PCR实验检测miR-497-5p表达水平。结果：补骨脂异黄酮呈剂量关系降低瘢痕疙瘩成纤维细胞活性、迁移率（P＜0.05），减少克隆细胞数（P＜0.05），降低Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達水平（P＜0.05），增加miR-497-5p表达水平。与miR-NC组相比，miR-497-5p组细胞活性、迁移率降低（P＜0.05），克隆细胞数减少（P＜0.05），Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表达水平降低（P＜0.05）。抑制miR-497-5p可以逆转补骨脂异黄酮对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移的影响。结论：补骨脂异黄酮可能通过上调miR-497-5p抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和迁移。

[关键词]补骨脂异黄酮；miR-497-5p；瘢痕疙瘩成纤维细胞；增殖；迁移

[中图分类号]R285    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2024）06-0060-04

Mechanism Study on Proliferation and Migration of Keloid Fibroblasts Regulated by Psoralen Isoflavones Via miR-497-5p

LIANG Bo1， LI Guodong2， MOU Jiangyue1， CUI Zhao1

（ 1.Department of Dermatology， Baoding Second Hospital， Baoding 071051， Hebei， China; 2. Department of Gastroenterology， Baoding First Central Hospital， Baoding 071030， Hebei， China ）

Abstract： Objective  To investigate the mechanism of psoralen isoflavones inhibiting the proliferation and migration of keloid fibroblasts by regulating miR-497-5p. Methods  Keloid fibroblasts were cultured in vitro and treated with 0， 9， 18， 36 μg/ml psoralen isoflavones， which were classified as Con group， low dose group， medium dose group and high dose group. The cells were transfected with miR-NC and miR-497-5p by liposome method， and were denoted as miR-NC group and miR-497-5p group. After transfection with anti-miR-NC and anti-miR-497-5p by liposome method， the cells were treated with 36 μg/ml psoralen isoflavones， which were denoted as high-dose group +anti-miR-NC group and high-dose group +anti-miR-497-5p group. Cell proliferation was detected by CCK8 and cloning assay. Cell migration was detected by wound healing test. The expression levels of Cyclin D1， MMP2 and MMP9 were detected by Western blot assay. The expression level of miR-497-5p was detected by qRT-PCR. Results  Psoralen isoflavones decreased the cell viability and migration rate of keloid fibroblasts （P＜0.05）， decreased the number of cloned cells （P＜0.05）， and decreased the protein expression levels of Cyclin D1， MMP2， and MMP9 （P＜0.05）， increase the expression level of miR-497-5p. Compared with the miR-NC group， the cell viability and migration rate of the miR-497-5p group were reduced （P＜0.05）， the number of cloned cells was reduced （P＜0.05）， and the protein expression levels of Cyclin D1， MMP2， and MMP9 were reduced （P＜0.05）. Inhibition of miR-497-5p can reverse the effect of psoralen isoflavones on the proliferation and migration of keloid fibroblasts. Conclusion  Psoralen isoflavones may inhibit the proliferation and migration of keloid fibroblasts by increasing miR-497-5p.

Key words： psoralen isoflavones; miR-497-5p; keloid fibroblasts; proliferation; migration

瘢痕疙瘩主要是外伤或自发形成过度增长的病理性瘢痕组织，与正常皮肤界限表现明显，瘢痕疙瘩一般呈暗红或紫红色，呈结节状或片状，常高出皮肤表面[1]。瘢痕疙瘩主要以手术、激光、药物治疗为主，但效果均不显著且复发率高，严重影响患者生活质量[2]。补骨脂是豆科植物补骨脂的成熟果实，具有温肾助阳、温脾止泻等功效，外用能够消风祛斑，有抗炎、抗菌和抗病毒等药理活性[3]。有研究结果显示，补骨脂异黄酮对人体皮肤创伤有治疗作用，可能与抗炎、抗氧化作用有关[4]，但是补骨脂异黄酮对瘢痕疙瘩的研究尚不清楚。miRNA是短链非编码RNA，與人类皮肤病有关，目前被证实的miRNA与瘢痕疙瘩有关，如miR-21、miR-141-3p、miR-181a等[5-6]。已有研究发现，miR-497-5p在瘢痕疙瘩成纤维细胞中呈下调表达，过表达miR-497-5p能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并诱导细胞凋亡[7]。关于补骨脂异黄酮和miR-497-5p对瘢痕疙瘩成纤维细胞的研究尚不清楚，鉴于此，本研究主要探究补骨脂异黄酮通过miR-497-5p影响瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和迁移的机制，现报道如下。

1  材料和方法

1.1 细胞和试剂：人瘢痕疙瘩成纤维细胞（中国科学院上海细胞库）；胎牛血清、DMEM培养基（美国Gibco公司）；补骨脂异黄酮（宝鸡市辰光生物科技有限公司）；miR-NC、miR-497-5p、anti-miR-NC、anti-miR-497-5p、引物（广州锐博公司设计合成）；Lipofectamine 2000试剂盒、TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）；CCK8试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；Cyclin D1抗体、MMP2抗体、MMP9抗体、GAPDH抗体（美国Cellular Signaling Technology公司）；逆转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix试剂盒（美国Promega公司）。

1.2 细胞分离和分组：将人瘢痕疙瘩成纤维细胞从液氮罐内取出，复苏后使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基孵育，培养条件为37℃、5%CO2。细胞生长状态融合度达到80%，采用0.25%胰酶消化培养细胞。取对数期人瘢痕疙瘩成纤维细胞病接种96孔板中，融合度为60%，使用补骨脂异黄酮浓度为9、18、36μg/ml处理细胞，分为低剂量组、中剂量组、高剂量组，以Con为对照，细胞内加DMSO试剂；按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书将miR-NC、miR-497-5p转染细胞内，记为miR-NC组、miR-497-5p组；按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书将anti-miR-NC、anti-miR-497-5p转染细胞后，使用补骨脂异黄酮浓度为36μg/ml处理细胞，记为高剂量组+anti-miR-NC组、高剂量组+anti-miR-497-5p组。各组细胞设置9个复孔。

1.3 CCK8、克隆实验检测细胞增殖

1.3.1 CCK8实验：收集各组人瘢痕疙瘩成纤维细胞然后以4×104个/毫升密度接种96孔板，培养48 h，然后加入10μl的CCK-8溶液，培养2 h，使用酶标仪检测细胞吸光度值（A），用来计算细胞活性（%）。

1.3.2 克隆实验：将人瘢痕疙瘩成纤维细胞按照1.2的方法处理，以每孔500个细胞接种6孔板中，放置培养箱内培养10～14 d，直至观察到克隆出现停止培养，使用甲醛固定细胞，结晶紫染色，显微镜下观察细胞数，记为克隆细胞数目。

1.4 伤口愈合实验检测细胞迁移：将对数期人瘢痕疙瘩成纤维细胞接种6孔板中，细胞融合度生长到80%，使用无菌枪头垂直划线，使用PBS漂洗细胞2次，加入不含血清的培养液，培养24 h。在0、24 h时拍照，计算细胞迁移率。细胞迁移率（%）=（0 h时划痕宽度-24 h时划痕宽度）/0 h时划痕宽度×100%。

1.5 Western blot实验检测Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表达：取各组人瘢痕疙瘩成纤维细胞培养48 h，将总蛋白提取后经过BCA法检测定量蛋白浓度，然后将蛋白样品使用SDS-PAGE凝胶分离蛋白，电泳结束迅速完成转膜，在5%脱脂奶粉中封闭培养2 h，4℃加入一抗Cyclin D1（1∶800）、MMP2（1∶800）、MMP9（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）过夜孵育，次日与稀释浓度为1∶5 000的二抗室温孵育2 h，加入ECL试剂进行显色，曝光、拍照。使用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH作为内参计算目的蛋白表达。

1.6 qRT-PCR实验检测miR-497-5p表达水平：取各组人瘢痕疙瘩成纤维细胞加入TRIzol试剂提取总RNA，紫外分光度计检测RNA浓度，观察是否在1.8～2.1之间，使用逆转录试剂盒合成cDNA，然后用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行扩增反应。以U6作为内参，按2-ΔΔCt法计算miR-497-5p表达水平。

1.7 统计学分析：实验数据通过SPSS 19.0统计软件处理，实验结果以均数±标准差（x?±s）表示，四组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 补骨脂异黄酮对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响：与Con组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组细胞活性降低（P＜0.05），克隆细胞数减少（P＜0.05），Cyclin D1蛋白表达水平降低，且呈剂量依赖性（P＜0.05）。

2.2 補骨脂异黄酮对瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移的影响：与Con组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组迁移率降低（P＜0.05），MMP2、MMP9蛋白表达水平降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性。

2.3 补骨脂异黄酮对瘢痕疙瘩成纤维细胞miR-497-5p表达的影响：与Con组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组miR-497-5p表达水平升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性。

2.4 上调miR-497-5p对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和迁移的影响：与miR-NC组相比，miR-497-5p组miR-497-5p表达水平升高（P＜0.05），细胞活性、迁移率降低（P＜0.05），克隆细胞数减少（P＜0.05），Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表达水平降低（P＜0.05）。

2.5 抑制miR-497-5p对补骨脂异黄酮处理瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移的影响：与高剂量组+anti-miR-NC组相比，高剂量组+anti-miR-497-5p组miR-497-5p表达水平降低（P＜0.05），细胞活性、迁移率升高（P＜0.05），克隆细胞数增多（P＜0.05），Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表达水平升高（P＜0.05）。

3  讨论

瘢痕疙瘩是皮肤科常见良性肿瘤，与成纤维细胞过度增长且胶原分泌过多有关[8]。瘢痕疙瘩治疗方法比较多，但是容易复发从而影响治疗效果，近年研究结果发现，中医治疗瘢痕疙瘩效果明显[9]。如雷公藤红素可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并促进细胞凋亡[10]。补骨脂外用可治疗牛皮癣、斑秃等皮肤病，化学成分丰富多样，药理研究显示具有良好的抗炎、抗肿瘤、抗菌等作用[11-12]。研究结果显示，补骨脂酚通过增加COL-I表达，降低MMP-1、MMP-3表达，抑制紫外线诱导的光老化人皮肤成纤维细胞胶原合成[13]。补骨脂素对紫外线诱导的人皮肤角质形成细胞老化有保护作用[14]。还有研究结果显示，补骨脂异黄酮对中波紫外线诱导的人皮肤成纤维细胞凋亡具有保护作用，并能提高细胞抗氧化酶活性[15]。但是补骨脂异黄酮对瘢痕疙瘩研究不清楚。本研究结果显示，补骨脂异黄酮呈剂量效应降低细胞活性、迁移率，减少克隆细胞数，降低Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表达，提示补骨脂异黄酮抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和迁移，从而抑制瘢痕疙瘩形成。

既往研究结果显示，miRNA与瘢痕疙瘩发生发展有关[16]，如miR-21在瘢痕疙瘩成纤维细胞表达增加，miR-21通过降低Smad7表达抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原蛋白合成[17]。另有研究结果显示，在瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-34a表达降低，其可能通过降低SATB1抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移和侵袭[18]。在瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-141-3p表达降低，上调miR-141-3p抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和迁移[19]。还有研究结果显示，在瘢痕疙瘩组织中miR-152-5p低表达，Smad3是miR-152-5p靶基因，高表达miR-152-5p对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移有抑制作用，并促进细胞凋亡[20]。已有研究显示，miR-497-5p与瘢痕疙瘩发展有关，可以作为瘢痕疙瘩潜在标记物[7]。本研究结果也显示，补骨脂异黄酮处理瘢痕疙瘩成纤维细胞后miR-497-5p表达增加，提示补骨脂异黄酮可能调控miR-497-5p表达。上调miR-497-5p能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和迁移，进一步实验结果显示，抑制miR-497-5p对补骨脂异黄酮处理瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移的影响，提示补骨脂异黄酮可能通过增加miR-497-5p抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和迁移。

综上所述，补骨脂异黄酮抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和迁移，可能与miR-497-5p有关。

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[收稿日期]2022-11-28

本文引用格式：梁博，李國东，牟江月，等.补骨脂异黄酮通过miR-497-5p调控对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和迁移的机制研究[J].中国美容医学，2024，33（6）：60-64.