乳品掺假检测技术研究进展

赵成莹，袁 静，王宝菊，刘恒煜，刘承军，周广驰，李志强，刘 晓

1 聊城市东昌府区畜牧兽医事业发展中心，山东聊城 2520002 聊城市畜牧兽医事业发展中心，山东聊城 252000

0 引言

乳品含有蛋白质、碳水化合物、脂肪等多种营养物质，是人体获得优质能量的重要来源。不同动物来源的乳具有一定差异，如骆驼乳、羊乳、马乳、驴乳等特种乳价格相比普通牛乳更昂贵[1]。这些乳的价格昂贵除了产量低外，还有其他高营养价值的原因，例如骆驼乳因为不含β乳球蛋白，不饱和脂肪酸比例高，且富含较多营养物质，所以具有较高市场价值，原料价格达50 元/kg，是牛奶的10倍，且纯骆驼粉售价通常达1 200～1 900 元/kg[2]。为谋取更大利润，有的商家为降低成本，将牛乳掺入其他类乳中售卖。研究者对市售特种乳样本检测发现，33 份乳样中掺假率高达48.48%，严重扰乱市场[3]。国际药典委员会的调查报告显示，在25 种最容易掺假的食品成分中，乳成分掺假相关学术研究排第2，媒体相关报道排第7[4]。牛乳中含有超过30 种具有潜在致敏性的蛋白质，也是世界卫生组织认定的过敏性食物之一。掺假产品出现，容易引发一些对牛乳过敏的人群过敏，还涉及某些特殊医疗要求和宗教信仰[5]。这种掺假不仅影响市场稳定，还损害养殖人员的经济利益，危害消费者身体，且不利于特种乳市场发展壮大。常规检测手段很难对其检测分辨，目前主要通过检测其不同种属来源的蛋白质、脂肪酸和核酸进行区分，但都具有弊端。探究快速高效的新型检测技术对促进乳业发展具有重要意义。本文通过分析特种乳掺牛乳的现状，综合概述各检测手段原理和优缺点，为特种乳掺假牛乳检测技术的发展提供参考。

1 乳品掺假检测技术

自2008年三鹿婴幼儿奶粉事件开始，从最初往牛奶中掺水、淀粉、尿素、三聚氰胺、植脂末和水解动植物蛋白，发展到往特种乳中掺牛乳，乳品掺假问题出现不同变化。目前根据检测机理不同，主要分为以下3 种类型。

1.1 基于蛋白质的掺假检测技术

蛋白质作为乳品中最主要的营养物质，其数量和种类较多，通常混杂在一起。常规的双缩脲法和凯氏定氮法等，只能检测其蛋白质浓度，对具体的蛋白质特性难以检测，因此通常将蛋白质分离后进行定性定量的检测或利用蛋白质抗原抗体的特性进行检测[6]。

1.1.1 蛋白质电泳技术

通过电泳将蛋白质分离开，对不同类型乳中的差异性蛋白进行检测，主要有二维凝胶电泳、毛细管电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和微流体芯片电泳等技术。聚丙烯酰胺凝胶电泳是利用聚丙烯酰胺的特殊网状结构，利用分子筛作用和电荷作用将蛋白质进行分离的过程[7]。Pesic等[8]建立聚丙烯酰胺电泳对山羊乳和绵羊乳中掺入的牛乳进行定性和定量分析方法，通过对其α酪蛋白和β酪蛋白的条带强度进行定量分析，有望用于乳掺假的快速检测。阿力木·吾布力等[9]通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）电泳发现，与牛乳的乳清相比，山羊乳乳清缺乏乳铁蛋白、骆驼乳缺乏β乳球蛋白、驴乳缺乏α乳白蛋白，可根据这一特性对不同特种乳中的掺假进行检测，并发现牛乳掺入山羊乳、骆驼乳和驴乳的体积有效鉴别比例分别为1∶4，1∶10和1∶10。毛细管电泳是在外部高压电场作用下，利用石英毛细管对物质进行分离。田兰等[10]利用毛细管电泳方法分离检测乳品中的5 种乳源蛋白质，并可测量乳粉和液态乳，具有较好的便捷性。Trimboli等[11]利用毛细管电泳方法检测马苏里奶酪中掺入的牛乳成分，该方法具有较高线性标准，R2=0.968，相对标准差为1.18%。二维凝胶电泳是先利用等点聚焦技术，通过蛋白质所带电荷不同进行初步分离，然后再进行SDS-PAGE，利用蛋白质电荷和分子量大小的不同进行全面分离。向明霞等[12]利用双向电泳方法对酪蛋白和乳清蛋白的同源性进行检测分析，为探索未知蛋白提供技术依据。微流体芯片电泳是将样品放于电场下，使其在含有芯片的管道中泳动，并将泳动产生的信号转为电信号后进行分析。尹艳[13]对比SDS-PAGE和微流体芯片电泳的优缺点，发现微流体芯片电泳的检测速度更快，准确性更高。

1.1.2 蛋白质色谱检测技术

液相色谱技术也是常用于分离、鉴定和定量乳中组分的分析技术之一，主要通过将样品混合物送入色谱柱中，根据不同组分的穿过速度以及与色谱柱的相互作用而分离[14]。李玲玉等[15]以牛乳中的β乳球蛋白为标记物，利用液相色谱技术对驼乳中掺入的牛乳进行检测，发现该方法具有较高的灵敏度，且在鲜乳、巴氏杀菌乳和乳粉中的检出限分别为2%、3%和5%，并利用该方法对10 种市售驼乳粉进行检测，发现其中4 种存在掺假。Ferreira等[16]同样以β乳球蛋白为标记物，建立反相高效液相方法，测定并检测牛乳和羊乳的混合乳，发现可在5%～95%的浓度范围内检测不同乳种。Yang等[17]利用液相-质谱联用技术对乳中掺入的植物性蛋白进行检测分析，发现掺入植物蛋白的乳和正常牛乳之间具有不同多肽的保留峰，通过主成分分析后能用于区分掺假乳。Guarino等[18]利用液相色谱-电喷雾质谱技术分析山羊奶奶酪和牛奶奶酪多肽的区别，当山羊奶奶酪中牛乳占比超过50%或牛奶奶酪中羊乳超过2%时，均可检测出来。杜文博[19]通过气相色谱-质谱联用技术对15 份羊奶粉中共有的正己醛、庚烯醛等挥发性特征风味物质，并作为参照物用于检测羊乳中掺入牛乳的指标，发现随着牛乳掺入增多，挥发性特征风味物质的检测量越少。

1.1.3 近红外光谱检测技术

近红外光谱可检测出被扫描样品混合物的组成和相关有机化合物的分子结构。Pereira等[20]利用近红外光谱和偏最小二乘法对羊乳中的牛乳掺假进行鉴定和定量分析，发现该方法能鉴别羊乳中1%的牛乳组分。邹婷婷等[21]通过近红外光谱对掺了牛乳的羊乳进行检测，建立分析模型，分析发现该模型能对羊乳粉中0.1～0.3 ng的牛乳粉进行检测。刘永峰等[22]建立牛奶中尿素氮的近红外检测模型，通过目标函数法对其效果进行评定发现，其相关系数能达0.986 4，定标标准差为0.238，说明该方法具有较好适用性和准确性。

1.1.4 蛋白质免疫学检测技术

免疫球蛋白G（IgG）是1 种重要免疫因子，能在乳中稳定存在，具有一定的物种特异性，适用于不同乳之间的掺假检测。杨洁等[23]根据驼乳和牛乳中蛋白种类和组成差异，通过定性检测驼乳源的α乳白蛋白、αs1酪蛋白、牛源性β乳球蛋白和κ酪蛋白，建立1 种检测驼乳中掺入牛乳的间接酶联免疫吸附试剂盒，具有前处理简单、过程快捷方便的特点。吉日木图等[24]利用驼乳中的特异性重链抗体IgG3为目标蛋白，快速检测驼乳中掺入其他特种乳的方法，具有检测效果好、灵敏度高、检测时间短的优点。王士峰等[25]利用牛β-酪蛋白免疫小鼠，制备单克隆抗体3B9能特异性识别牛乳酪蛋白，并利用该方法检测羊乳中掺入的牛乳，检测范围2.68～3.21 μg/mL， R2=0.996 6。薛海燕等[26]选择κ酪蛋白为目标蛋白，以兔血清IgG和鸡卵黄抗体IgY为检测抗体，建立牛乳掺假ELISA定量方法。当κ酪蛋白为0.098～3.125 mg/L时，具有良好线性关系。Song等[27]以免疫磁珠为固相，β酪蛋白单克隆抗体吸附于免疫磁珠上作为捕捉探针，以辣根过氧化物酶作为检测探针，检测牛乳中的β酪蛋白。该方法的最低检测限能达0.4 μg/mL，30 min内可完成检测。张世伟等[28]通过双抗体夹心方法检测羊乳和水牛乳中掺伪牛乳，灵敏度能达0.1 μg/mL，检测时间1 h。

1.2 基于核酸的掺假检测技术

乳中除含较多营养物质外，还有一定数量的体细胞，因此可提取其中的DNA作为掺假检测指标。由于乳中存在DNA含量较低，通常利用PCR扩增技术对目标DNA片段进行扩增快速检测。Dalmasso等[29]以牛乳中的Cytb为靶基因，设计特异性较强的引物和探针，对掺入牛乳进行快速检测，具有较高灵敏度，最低检出限能达2%。杨艳歌等[30]针对8 种不同乳设计不同特异性引物，通过RT-PCR技术检测发现该方法能区分不同种的乳样，检出限能达0.1%，绝对灵敏度达0.1～5 pg/μL。黎颖等[31]通过双重PCR对羊乳中掺入的牛乳进行检测，发现当牛乳掺入比例为1%，在酸奶中掺入比例为10%时，均能被准确检测出来。Caterina等[32]通过荧光RT-PCR技术，建立能快速同时鉴定奶牛乳、羊乳、水牛乳等不同种属乳源的检测方法。总之，PCR在乳品真实性检测中具有灵敏度高、准确性好的优点，但经过高温杀菌或其他加工工艺处理后的乳中DNA会不同程度破坏，对该方法的实用性有一定影响。

1.3 基于脂肪酸的掺假检测技术

气相色谱技术可利用混合物不同组分的结构差异，在两相之间的滞留时间不同进行分离鉴定。如羊乳中的长链脂肪酸C16：0和C18：0、不饱和脂肪酸C18：1和C18：3等脂肪酸的含量均低于牛乳，而短链脂肪酸C6：0、C8：0、C10：0和C12：0的含量则显著高于牛乳，因此可根据该差异对乳品中的掺假进行检测[33]。许昀晖等[34]通过气相色谱-质谱联用技术对6 种家畜乳中的脂肪进行检测，建立相应脂肪指纹图谱，根据脂肪类别判断乳品种类，具有较好的实用价值。郭紫玥[35]通过气相色谱-质谱联用技术对牛乳、羊乳和人乳中脂肪酸差异进行对比分析，发现其ARA、DHA和EPA这3 种多不饱和脂肪酸存在变化和差异，可在后续乳品加工与开发中根据该特性进行加工优化。

2 其他相关乳品检测技术

除上述方法外，电子鼻、核磁共振等技术也广泛用在乳品掺假检测中。电子鼻可通过气味检测器对其中风味物质的变化进行检测，并将其转变为电信号，集合相应的定量分析方法进行综合分析。吴丹丹等[36]利用电子鼻对气味特征的区别记录分析，建立1 种分辨驼乳中掺入牛乳的检测方法，最低检测线能达1%。金嫘等[37]用电子鼻对混入羊乳中的牛乳进行检测，并进行主成分分析和线性判别分析，发现电子鼻能有效对掺入其中的牛乳识别鉴定。高晓霞等[38]利用电子鼻技术对奶粉中掺入的豆粉、尿素以及植脂末等物质分析检测，发现电子鼻均能有效检测出其中的掺假成分。核磁共振技术主要根据食品中蛋白质、水分、脂肪等物质中的氢核吸收电磁能，发生能级迁跃产生弛豫现象。苗志英等[39]采用1H质子核磁共振对牛乳中掺入的尿素、水和蔗糖等物质进行检测，掺假物质会与牛乳中的蛋白质争夺水分子，使1H增多导致T2张驰时间延长，发现随掺假浓度增高而更明显，从而判定掺假乳的成分和特性。斯仁达来[40]通过低场核磁共振技术对驼乳中掺入的牛乳进行检测，发现检测限均在10%。

3 总结

乳品掺假是食品安全中长期存在问题。保证乳品质量安全，发展相应的质量检测技术方法十分重要。虽然液相色谱、近红外光谱等技术能满足目前掺假测试需求，但成本高、操作复杂等，未能普遍应用。常规的电泳和PCR方法虽然准确度较高，但无法满足大批量快速检测需求。开发灵敏度高、可操作性强、成本低的检测方法十分重要。在上述多种检测方法中，以酶联免疫吸附试验为基础的检测试剂盒具有较好发展潜力，便捷、快速，操作性强。只有对各种掺假检测技术深入了解，加强其实用性和发展前景评测，才能保证乳品安全。