牛传染性鼻气管炎病毒的生物学特性、诊断方法和流行现状

崔 平，王惠霞，李本科

滨州市农业技术推广中心，山东滨州 256600

0 引言

奶牛受多种病毒侵害，其中传染性较强的鼻气管炎是一种危害性极强的病毒性传染病。牛传染性鼻气管炎又称“坏死性鼻炎”或“红鼻病”，常由于牛传染性鼻气管炎病毒（牛疱疹病毒Ⅰ型）引起的一种急性、热接触性传染病。该病毒入侵牛的呼吸道，主要表现为高热、呼吸困难、鼻炎、鼻窦炎，有时引发结膜炎、脑炎、子宫炎、肠炎、脓包性外阴阴道炎及产奶量下降，导致母牛流产或死胎等，治疗成本较大，给养殖场造成严重经济损失[1]。该病最早于20世纪50年代在美国科罗拉多的育肥肉牛中被发现，以鼻气管炎为主要症状，之后蔓延到加利福尼亚和洛杉矶等地，被命名为牛传染性鼻气管炎[2]。1956年Madin从病牛体内首次分离出了牛疱疹病毒Ⅰ型，证明牛传染性鼻气管炎由该病毒引起[3]。虽然奶牛感染牛传染性鼻气管炎病毒后病死率不高，但会导致机体免疫力下降，极易感染其它病原体[4]。该病临床上具有潜伏感染期和隐性感染的特征，感染后自愈奶牛仍携带病毒，且无明显病症，为隐性感染，能向其他健康奶牛传播病毒，导致奶牛患病，这也是该病持续感染、难以治疗清除彻底的主要原因[5]。该病可通过多种方式传播且速度极快，在大型集约养殖场，感染后阳性率可达70%以上，对肉牛生长和奶牛产奶量造成巨大影响。患病严重的地区会被列为疫区，禁止出口相关畜产品，造成养殖场经济损失[6]。牛传染性鼻气管炎被世界动物卫生组织列为必须报告的B类动物疾病，我国将该病列为二类动物疫病，是牛类进出口的必检项目[7]。因为该病毒只有一种血清型，目前预防该病最有效方式是注射相关疫苗[8]。为最大程度降低该病带来危害，需研究牛疱疹病毒Ⅰ型的病原学、理化特性和基因组成结构等生物学特性，选择合适快捷的诊断方法，了解流行现状，做好预防，降低危害。

1 鼻气管炎病毒的生物学特征

1.1 病毒的形态结构及理化特性

牛传染性鼻气管炎由疱疹病毒属的牛疱疹病毒Ⅰ型引起，是疱疹病毒科的a疱疹病毒亚科水痘病属[9]。牛传染性鼻气管炎病毒具有疱疹病毒类似外形，为正二十面体的对称结构，外表类似球形，直径150～220 nm，主要由外层囊膜、内部衣壳和核心三部分组成[10]。该病毒的衣壳外观呈六角形，直径80～120 nm，囊膜由宿主细胞来源的脂质和病毒编码的蛋白或糖蛋白构成，核心是由双股的DNA与蛋白质相互缠绕构成[11]。

牛疱疹病毒Ⅰ型对外界具有较强抵抗力，37 ℃能存活10 d， -4 ℃能存活30 d，-20 ℃能存活数月，-70 ℃能存活数年，但在56 ℃温度下21 min即失去活性，因此实验室中该病毒常在超低温冰箱中（-80 ℃）保存[12]。该病毒对乙醚、丙酮、氯仿等有机溶剂较敏感，多种消毒剂（如0.5% NaOH溶液、1%酚类衍生消毒剂、1%季铵碱溶液、5%甲醇溶液和75%的酒精等）均可灭杀该病毒[13]。Straub[14]发现牛传染性鼻气管炎病毒在0.5% NaOH、0.01%HgCl2、1%漂白粉和1%酚类中数秒钟即可被灭杀，在5%甲醛溶液中1 min即可灭活。该病毒在10 次以内的冻融时毒价不会降低，但经过胰蛋白酶消化后病毒感染力下降，且耐碱不耐酸，pH值6～9时可稳定存活，所以常保存在pH值7.0的细胞培养液中[15]。

1.2 病毒的基因学特征和相关蛋白组成

牛疱疹病毒Ⅰ型含有一个线性的双股DNA基因组，长度约138 kbp，G+C占71%～72%，全序列主要包含长度106 kbp的长独特区、长度为10 bp且带有22 kbp重复序列的短独特区。短独特区两端分别为反向的内部重复序列和末端重复序列（各11 kbp）。在DNA复制期间，长独特区和短独特区可翻转，在DNA内串联，生成病毒基因组的4 种异构体[16]。

牛疱疹病毒Ⅰ型基因组中，目前已鉴定73 个开放阅读框，其编码的蛋白质也已被定位[17]。该基因组能编码33 种结构蛋白，其中12 个结构蛋白与囊膜形成有关，存在于病毒的粒子囊膜和病毒感染细胞的浆膜上。编码的囊膜蛋白中，糖基化的蛋白10个，未糖基化的2 个。10 个糖基化蛋白基因位于基因组长独特区有6 个（gL（UL1）、gM（UL10）、gH（UL22）、gB（UL27）、gC（UL44）、gK（UL53）），位于短独特区有4个（gE（US8）、gI（US7）、gG（UL4）、gD（UL6））[18]，其中gB、gD、gH、gL和gK是病毒在细胞中生长的必需蛋白，而gB、gC、gD、gE为发挥毒性作用主要的糖基化蛋白，能刺激机体产生中和抗体。gB蛋白帮助病毒吸附和穿入宿主细胞，gC蛋白是病毒最重要的吸附蛋白，gD蛋白可刺激宿主机体产生持久的细胞免疫反应，gE蛋白主要作用于病毒在细胞间的传播[19]。

对gB蛋白的研究较多，已完成克隆、测序等。GenBank 公布的完整gB基因有2 799 个核苷酸，位于长特异区，成熟gB蛋白的分子质量129 kDa，为2个74 kDa和55 kDa的多肽通过二硫键结合组成。该蛋白具有5 个能被机体免疫系统识别的位点，刺激机体发生免疫反应，还可与硫酸肝素结合代替gC蛋白的附着功能[20]。

gC蛋白同样位于长特异区，分子质量为91 kDa，存在于病毒囊膜表面，具有多个抗原表位，具有较强吸附作用，能协助病毒穿透细胞。研究者将gC蛋白的表达基因敲除后，发现病毒在牛上呼吸道中的复制滴度显著降低，说明该蛋白可能与病毒复制相关[21]。

gD蛋白由399 个氨基酸组成，分子质量为71 kDa，是牛疱疹病毒Ⅰ型复制的必需基因和主要结构蛋白。相比其他蛋白，gD蛋白能刺激机体产生更强免疫反应，能同时刺激体液免疫和细胞免疫。免疫实验结果证明，单独gD蛋白引起免疫反应比gB蛋白和gC蛋白更强烈，因此gD蛋白常为研究牛传染性鼻气管炎特异性抗原的首要选择[22]。

gE蛋白是主要的毒力因子，由575 个氨基酸组成，分子质量为65 kDa，主要作用于病毒在细胞间传播和诱导宿主机体免疫应答。该蛋白属于跨膜蛋白，且胞外区是机体免疫系统识别的靶向抗原，常暴露在病毒颗粒表面。通常gE蛋白会和gI蛋白形成异二聚体，在宿主细胞内发挥运输作用[23]。

除以上基因和蛋白外，TK基因也是牛传染性鼻气管炎病毒主要的毒力因子之一，在核酸代谢过程中起主要作用，是病毒复制过程中的非必需基因，也调节着病毒在神经细胞中的潜伏能力。缺失TK基因的病毒复制能力、毒力和潜伏能力大幅度下降，所以通常该基因被选为编辑基因缺失疫苗的首选靶基因[24]。同时，病毒中Vhs蛋白会加速细胞中mRNA降解，破坏细胞多聚核糖体结构；其中VP8蛋白能够改善病毒的复制，当蛋白表达下降后会导致病毒的感染滴度下降，还会影响gB、gC和gD蛋白的表达量。这也是牛传染性鼻气管炎病毒具有较强传播性、潜伏性和致病性的原因[25]。

2 鼻气管炎病毒的诊断方法

对牛传染性鼻气管炎病毒感染的鉴定诊断有多种方式，常通过细胞分离鉴定、组织病理学、血清学、聚合酶链式反应（PCR）和实时荧光PCR、酶联免疫吸附试验（ELISA）和电子显微镜等。其检测样本采集通常根据临床症状不同进行选择，如呼吸道型采集鼻拭子、生殖道型公牛采集精液、母牛采集阴道分泌物、流产型采集胎儿胸水、肺等组织液。

2.1 病毒的分离鉴定

通过细胞进行病毒的分离鉴定是最简单的方法，目前最常用的是牛胎肾传代细胞和牛气管传代细胞，可将病毒接种到细胞上，观察细胞病变程度，判断病毒分离结果。该方法约需3 d。细胞从细长贴壁状态转变为椭圆形且聚集漂浮在细胞培养液中，说明出现病变，之后取细胞培养物与病毒阳性血清或单克隆抗体进行中和实验。该方法被世界动物卫生组织定为国际贸易试验方法之一[26]。虽然该检测方法较可靠，但费时费力，不适用于大批量检验检疫。

2.2 组织切片和电子显微镜观察

该病毒能在牛的多个组织细胞生长繁殖（如肾、睾丸、皮肤和肺等），且能形成核内包涵体，所以可选取牛病变部位制备切片，进行荧光桃红和酒石黄染色法观察。通过显微镜可看到细胞核被染为蓝色，包涵体为红色，胶原为黄色[27]。在疾病早期感染阶段，可通过电子显微镜观察样本中病毒颗粒的形态特征，从而快速诊断。

2.3 聚合酶链式反应（PCR）和实时荧光PCR

聚合酶链式反应是用于检测病毒最常用、可信度最高的检测方法，可在几小时内获得检测结果，适用于大批量样本快速检测。1993年Wiedmann等[28]首次将PCR用于检测牛传染性鼻气管炎病毒，建立相应检测方法，数小时内可获得结果。PCR检测技术被认为和病毒分离、斑点免疫杂交等手段具有相同准确性。但PCR常由于样品污染或操作不当而出现假阳性结果，因此，实时荧光PCR技术成为新选择。

实时荧光PCR相比普通PCR具有更高灵敏度、更强特异性和更好重复性，且随着反应时间推移，检测信号被逐步放大，能有效降低污染风险。刘占悝等[29]通过优化实时荧光PCR技术，发现其检测下限最低可到3.04×101 copies/μL，有较好灵敏度。

2.4 血清学检测方法

2.4.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验可以用来诊断疾病是否受细菌或病毒感染，具有操作简单、灵敏度高和速度快等优点，是国际贸易中较认可的检测方法。特别是牛传染性鼻气管炎病毒中的gB、gC、gD、gE和gG蛋白都具有良好的免疫原性，常被作为ELISA检测的靶蛋白，这也侧面提高ELISA检测的准确性。目前已有阻断ELISA法和间接ELISA法试剂盒应用于该病毒检测，且阻断ELISA试剂盒的敏感性相比间接ELISA试剂盒更高[30]。

2.4.2 中和试验

病毒中和试验在血清学诊断检测方法中是最标准和经典的牛传染性鼻气管炎病毒检测技术[31]。由于该病毒的血清型只有1 种，可将样品与病毒的阳性血清混合后判断结果，缺点是灵敏度不高，容易出现假阳性。

2.4.3 胶体金技术

胶体金技术是以胶体金为显色物质，检测抗原或抗体的分子免疫标记技术，常用的是斑点免疫渗滤法和胶体金免疫层析法，具有便携、灵敏度高、随时检测等优点。我国研究者利用胶体金技术建立了牛疱疹病毒Ⅰ型胶体金检测方法，其普通PCR相比其阴性符合率高达99.17%[32]。

3 鼻气管炎的传播特性和流行现状

自然条件下牛传染性鼻气管炎病毒的唯一宿主是牛，且各品种、年龄和性别的牛均有被感染的风险。秋冬季由于温度、湿度和通风环境变化，会使该病的发病率上升。该病毒可通过空气和接触传播，感染后病牛常有10～20 d潜伏期，之后出现明显的临床症状。感染后常体温升高、食欲下降、精神不佳、呼吸不畅且鼻腔伴有溃烂，流出大量粘液，哺乳期母牛产奶量减少等，给奶牛养殖造成严重影响[33]。

该病最早发生在北美洲，Madin等学者分离出病毒毒株。随着对该病毒不断深入研究，大量病毒从健康牛，子宫炎、肺炎、呼吸道感染和乳腺疱疹性皮炎的牛中分离出来[34]。Saundeks等[35]对加拿大萨斯喀彻温省1 077 头牛开展血清抗体临床调查，发现其中518 头含有病毒的中和抗体，阳性率达48.1%。除了北美洲，欧洲也是较早存在该病毒的地区。冯学平[36]对瑞士弗里堡和澳大利亚的多起牛传染性鼻气管炎调查发现，由于进口白星公牛为隐性携带者，导致该病传播。Wiseman等[37]对英国西部不同牛种群（肉牛、奶牛、犊牛）暴发的15 次传染性鼻气管炎进行调查，发现奶牛群中的发病率最高，达90%，且泌乳量明显下降。大洋洲是奶牛养殖大洲，陈国强等[38]对大洋洲进口奶牛的病毒感染进行研究，发现澳大利亚和新西兰广泛存在牛疱疹病毒1型感染，且澳大利亚不同的牛群病毒阳性率为15%～96%，感染率极高。Patil等[39]对印度安达曼和尼科巴群岛11 个村庄的418 份牛血清样本进行检测，发现107 份为阳性，阳性率25.60%。我国也有较多奶牛传染性鼻气管炎报道。皇甫和平等[40]对河南省5 个不同区域的12个规模化奶牛养殖场的440 份样本调查研究发现，阳性患病奶牛68 头，总体患病率15.45%，每个养牛场均有阳性样本被检测出，且阳性率最高的养牛场达68%。叶丽娜[41]对北京市不同地区的2 582 份牛血样本分析发现，总阳性样本数902 份，平均阳性率34.93%，其中房山区样本的阳性率达100%。孙庆宇等[42]对内蒙古16 个奶牛养殖场进行调查，发现平均阳性率75.7%。希尼尼根等[43]对内蒙古的457 头牛进行血清学流行病学调查，发现中东部地区较严重，某些养牛场的阳性率达100%，全自治区的平均阳性率29.5%。王永艳等[44]对山西省12 个区县的665 头奶牛检测发现，阳性率49.6%。苏姣秀等[45]对广西27 个奶牛群的717 头奶牛采样检测，发现阳性率26.74%。总之，牛传染性鼻气管炎病毒在全世界广泛流传，我国各地也广泛流传。预防该病毒传播，降低影响，对奶牛养殖业发展至关重要。

4 小结

随着研究深入，对牛传染性鼻气管炎病毒的认知逐渐清晰，特别对其结构、形态、功能和感染机制越来越了解。而对于该病毒的分离检测和鉴定手段也在不断更新，更简单、快速、便捷和高效的检测方法是未来疾病检测手段的发展趋势。因此，加强对该病及病毒认知，做好病毒的检测工作，做好牛传染性鼻气管炎防控，有利于降低该病对奶牛机体健康及生产性能的影响，保证奶牛养殖业健康持续发展。