响应面法优化超声波辅助提取白头翁总皂苷

于爽　郝婧玮　孙晓薇　高剑　李帅　杨传伟

摘要：采用响应面法优化了超声波法辅助提取白头翁总皂苷（pulsatilla saponin）的条件。以白头翁皂苷B4提取率为评价指标，在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken响应面分析法，确定最佳提取条件。结果表明，超声波辅助提取白头翁总皂苷的最佳工艺参数为超声功率240 W，乙醇体积分数60%，超声时间30 min。在此条件下白头翁皂苷提取得率为5.35%。响应面法优化得到的提取工艺稳定合理，准确可靠，是提取白头翁皂苷的可行方法。

关键词：白头翁皂苷（pulsatilla saponin）；超声波辅助提取；响应面法

中图分类号：TS229 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）04-0707-05

中药白头翁为毛茛科植物白头翁[Pulsatilla Chinensis（Bge.） Regel]的干燥根，始载于《神农本草经》，其性味苦寒，具有清热解毒、凉血止痢、燥湿杀虫之功效[1，2]。其化学成分有白头翁皂苷（pulsatilla saponin），胡萝卜甙，白头翁素等，主要有效成分为白头翁三萜皂苷[3，4]。现代药理研究表明，它具有增强免疫力，抗炎、抗肿瘤、抗病原微生物等作用[5，6]，尤其在抗肿瘤及抗癌的新药开发方面有很大的应用潜力[7，8]。近年研究还发现其所含的某些活性成分对治疗老年性痴呆（阿尔茨海默病）效果显著[9，10]。

近年来，超声波技术已经被普遍应用于提取植物中生物活性物质，其具有能耗低、效率高、不破坏有效成分等特点。超声波在液体介质中传播时，可以在样品和溶剂间产生特殊的空化作用，超声波空化时产生的极大压力可以提高细胞壁的通透性，使细胞内的成分释放，直接与溶剂接触并溶解，提高了成分从固相转移到液相的传质速率[11-13]。本研究以白头翁皂苷B4的提取得率为指标，研究了影响白头翁总皂苷超声辅助提取效果的各因素，并通过响应面分析法，确定了最佳提取工艺条件，为进一步开发利用白头翁的药用价值提供了可靠依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白头翁饮片，产地东北，购自蔺氏盛泰药业有限公司；白头翁皂苷B4标准物质（贵州迪大生物科技有限公司）；其他试剂均为分析纯。Waters 2695高效液相色谱仪（Waters公司）；Microfuge 22R台式微量冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司）；JAC-600超声波中药处理机（山东济宁超声电器有限公司）；色谱柱（4.6 mm×150 mm）；BSA2245S-CW电子分析天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；FZ102微型植物粉碎机（江东精密仪器公司）；自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣公司）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Shimadzu VP-ODS （4.6 mm×150 mm，4.6 μm），流动相为乙腈-水-磷酸（27∶73∶0.1，v/v），等度洗脱，洗脱流速为1.0 mL/min，检测波长为201 nm，柱温为25 ℃，进样体积10 μL，收集时间为17.201 min，定量方法为外标工作曲线法。

1.2.2 标准曲线方程 精密称取白头翁皂苷B4标准品3.00 mg置于5 mL容量瓶中，加入无水甲醇溶液定容至刻度，用0.45 μm微孔滤膜过滤，将白头翁皂苷B4标准品母液依次梯度稀释为0.300、0.200、0.100、0.050、0.025 mg/mL，按上述色谱条件测定峰面积，以质量浓度（mg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。以峰面积Y和皂苷含量X进行线性回归，得到回归方程为Y=2 586.4X-26.734，r=0.999 6，白头翁皂苷含量在0.025～0.600 mg/mL。

1.2.3 样品中白头翁皂苷的测定 将白头翁根粉碎，过50目筛，准确称取5.00 g按一定的料液比，分别加入一定浓度的乙醇溶液，设定超声功率和超声时间进行提取，提取完毕后，滤液4 000 r/min离心10 min，取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，精密吸取各供试品溶液10 μL，按上述给定的条件测定峰面积，以回归方程计算含量。

Y=CV/M×100%

式中，Y为提取得率；C为白头翁皂苷B4浓度（mg/mL）；V为提取液体积（mL）；M为原料质量（mg）。

1.2.4 超声波辅助提取白头翁皂苷的单因素试验 分别选取不同的粒径大小、乙醇体积分数、料液比（g/mL，下同）、超声时间、超声功率和超声次数进行单因素试验，考察各单因素对白头翁皂苷提取得率的影响。

1.2.5 响应面分析法优化白头翁皂苷的提取条件 在单因素试验的基础上，进一步考察超声功率、乙醇体积分数、提取时间对白头翁皂苷提取效果的影响，利用Box-Behnken来设计试验，根据中心组合试验设计原理，以白头翁皂苷提取得率为响应值，采用3因素3水平的响应面分析法，对超声提取条件进行优化，因素水平见表1。

2 结果与分析

2.1 超声辅助法提取白头翁皂苷的单因素试验

2.1.1 粒径大小对白头翁皂苷B4提取得率的影响 由图1可见，白头翁粉末颗粒越小，白头翁皂苷提取得率越高。当达到50目的粒径时，白头翁皂苷提取得率可达到5.19%，虽然60目的粒径，白头翁皂苷提取得率会略有增加，但样品过于细小会将其他的糖等物质溶出，不利于后续试验的进行，故选择50 目的白头翁粉末。

2.1.2 料液比对白头翁皂苷B4提取得率的影响 由图2可见，当料液比为1∶8时，白头翁皂苷的提取得率可以达到最大，溶剂的量再继续增加，白头翁皂苷提取得率反而下降，其原因可能是当溶剂用量增大到一定程度时，超声波能量过多的作用于溶剂，影响了白头翁皂苷提取得率，故料液比确定为1∶8。

2.1.3 乙醇体积分数对白头翁皂苷B4提取得率的影响 由图3可见，增大乙醇体积分数，白头翁皂苷提取得率呈上升趋势，乙醇体积分数为60%时，皂苷提取得率达到最大值5.33%，当体积分数继续增加，皂苷提取得率反而呈下降趋势。可能原因是过高的乙醇体积分数使得细胞壁处于收缩状态，阻碍了皂苷的溶出，故确定60%为乙醇的最佳体積分数。

2.1.4 超声功率对白头翁皂苷B4提取得率的影响 由图4可见，随着超声功率的增加，白头翁皂苷提取得率呈上升趋势，超声功率为60%（240 W）时，皂苷提取得率达到最大值5.33%，当超声功率超过60%（240 W）时，皂苷提取得率开始下降。因此确定超声提取功率为60%（240 W）。

2.1.5 超声时间对白头翁皂苷B4提取得率的影响 由图5可见，随着超声时间的延长，白头翁皂苷的提取得率先升高后降低，在30 min时得率达到最高为5.24%；30 min后皂苷的得率降低，原因可能是白头翁皂苷分子的化学键等被持续的超声波破坏，甚至是断裂，得到了其他产物，所以确定超声提取时间为30 min。

2.1.6 超声次数对白头翁皂苷B4提取得率的影响 由图6可见，随着超声次数的增加，白头翁皂苷提取得率呈上升趋势，且在第2次提取时增加明显，进一步增加超声次数，白头翁皂苷提取得率有所提高但不显著，考虑降低能耗及成本、节约溶剂，确定提取2次为宜。

综上所述，根据单因素条件试验，初步选定过 50目的白头翁粉末料液比1∶8，乙醇体积分数60%，超声功率240 W，超声时间30 min，超声次数2次为最佳提取条件，采用响应面法对超声辅助提取白头翁皂苷工艺条件进行优化。

2.2 响应面优化超声辅助溶剂提取白头翁皂苷

2.2.1 回归模型的建立及方差分析分析 超声功率（A）、乙醇体积分数（B）、超声时间（C）3个因素对白头翁皂苷得率（Y）的影响，采用响应面进行试验设计。试验设计及结果如表2。将所得试验数据通过软件Design expert 7.0进行多元回归拟合，白头翁皂苷提取得率与超声提取各因素变量的二次回归方程模型为：

Y=5.220+0.140A-0.096B+0.150C-0.200AB-0.089BC-0.470A2-0.560B2-0.630C2

根据回归方程模型及试验数据对其各项进行方差分析（表3）。由表3可知，二次回归方程模型可达到极显著（P<0.01）水平，其中，失拟项F=5.26（P>0.05）且误差小，表明该方程模型对试验数据处理及分析的结果有效可靠，决定系数为0.918 5，说明该模型的解释程度较高，可以反映出91.85%的响应值变化，拟合精度较好，可以预测白头翁皂苷的不同提取条件。根据各因素的F值比较可知，影响程度最大的因素是C，其次为B，A的影响程度相对较小。一次项（A、C）交互项（AB）对结果有着显著影响（P<0.05），二次项（A2、B2、C2）对结果影响极显著（P<0.01）。

2.2.2 响应面图分析 响应面图形是反映响应值与各个试验因素之间变化的三维图形，可从中分析出参数与最佳参数间的相互作用关系，测试因素间的交互作用关系由等高线的形状反映，若两因素相互作用显著则呈现椭圆形。当其形状越向圆形趋近时，交互作用越弱。如果为标准圆形，可认为这两因素之间的相互作用可忽略不计。由图7-图9可以看出，超声功率（A）、乙醇体积分数（B）、超声时间（C）3个因素与白头翁皂苷的提取得率（Y）呈抛物线关系，在自变量A、B、C的取值范围内，Y有着相应的极高值与其对应。

3 提取工艺条件的确定

为进一步确定最佳工艺点，在模型浓度范围内选择出发点，按照模型使用快速上升法进行优化，可得最佳理论工艺条件为超声时间29.35 min，超声功率59.08%，乙醇体积分数60.95%。考虑到实际应用，将提取工艺参数修正为超声时间30 min，乙醇体积分数为60%，超声功率为60%（240 W），白头翁皂苷提取得率达到5.45%，与理论值接近。因此，基于响应面法所得的优化提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。

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