基于GC-MS的保留指数分析黑胡椒精油挥发性成分

尹团章 邵佩 吴昭 程书锋

摘要：为分析海南产黑胡椒精油中的挥发性成分，为公众进一步开发利用黑胡椒提供科学依据，采用水蒸气蒸馏法制备了黑胡椒精油，并基于气相色谱-质谱联用技术结合保留指数对精油成分进行了定性分析。从黑胡椒精油中鉴定出了27种主要的挥发性成分，含量较高的组分为β-石竹烯（23.91%）、柠檬烯（17.23%）、3-蒈烯（19.30%）、β-蒎烯（7.83%）和石竹烯氧化物（3.01%）。对δ-杜松烯、柠檬烯、顺式香桧醇（cis-sabinol）、cyclohexene， 3-methyl-6-（1-methylethylidene）-（萜品油烯）、cyclohexene，1-methyl-4-（1-methylethylidene）-（萜品油烯）、对伞花烃（P-cymene）进行鉴定，使精油的定性结果更准确、可靠。

关键词：黑胡椒精油；保留指数；挥发性成分；气相色谱-质谱联用技术；水蒸气蒸馏法

中图分类号：TS264.3      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2024）04-0178-04

Analysis of Volatile Components in Black Pepper Essential Oil

Based on GC-MS Retention Index

YIN Tuan-zhang1， SHAO Pei1， WU Zhao2， CHENG Shu-feng2

（1.Wuhan Huanghelou New Materials Technology Development Co.， Ltd.， Wuhan 430040， China;

2.Wuhan Huanghelou Flavors & Fragrances Co.， Ltd.， Wuhan 430040， China）

Abstract： In order to analyze the volatile components in essential oil from black pepper produced in Hainan and provide scientific basis for the public to further develop and utilize black pepper， the black pepper essential oil is prepared by steam distillation method， and then essential oil components are analyzed qualitatively by gas chromatography-mass spectroscopy （GC-MS） combined with retention index. A total of 27 kinds of main volatile components are identified from black pepper essential oil. The components with higher content are β-caryophyllene （23.91%）， limonene （17.23%）， 3-carene （19.30%）， β-pinene （7.83%） and caryophyllene oxide （3.01%）. The identification of δ-cadinene， limonene， cis-sabinol， cyclohexene， 3-methyl-6-（1-methylethylidene）-（terpinolene）， cyclohexene， 1-methyl-4-（1-methylethylidene）-（terpinolene） and P-cymene makes the qualitative results more accurate and reliable.

Key words： black pepper essential oil; retention index; volatile components; gas chromatography-mass spectroscopy （GC-MS）; steam distillation method

收稿日期：2023-09-23

基金项目：湖北中烟工业有限责任公司科技项目（2021JSXL3XL2B021）

作者简介：尹团章（1972—），男，高级农艺师，博士，研究方向：香精香料技术。

胡椒科藤本植物黑胡椒（black pepper）学名Piper nigrun L.，为多年生热带和亚热带香辛料作物，素有“香料之王”的美誉，在巴西、印度、东南亚等地广泛种植，在我国广东、海南、福建等沿海地区也有种植[1-2] 。

黑胡椒精油是黑胡椒籽的主要深加工产品，具有强烈的芳香味和较强的抗氧化、防腐功能[3-4]，是食品行业一种重要的香料。国内外学者开展了一系列黑胡椒精油提取方法和挥发性成分分析的研究。徐可文等[5]采用水蒸气蒸馏法提取黑胡椒精油后，通过GC-MS和 FTIR（傅里叶变换红外光谱法）分析出丁香烯、1R-α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、D-檸檬烯为精油的主要特殊成分。王珏等[6]采用了3种精油提取方法，包括两种溶剂萃取法（分别以1∶1比例的戊烷与乙醚混合液、甲基叔丁基醚为溶剂）和顶空固相微萃取法，制得黑胡椒精油，通过主成分分析得出，具有较大香气风味贡献率的挥发性成分为β-石竹烯、柠檬烯、3-蒈烯、β-蒎烯。段梦雅等[7]采用水蒸气蒸馏法提取黑胡椒油、白胡椒油、青胡椒油和胡椒鲜果精油，成分分析得出萜烯类的β-石竹烯、D-柠檬烯、3-蒈烯等为4种精油的主要挥发性成分。侯冬岩等[8]采用蒸馏萃取法萃取了黑胡椒油并进行了成分分析，得出主要挥发性成分为石竹烯、柠檬烯、3-蒈烯和可巴烯等萜烯类化合物。Al-Sayed等[9]用水蒸气蒸馏法提取黑胡椒、白胡椒、长胡椒的挥发油，由分析结果可知黑胡椒、白胡椒的挥发油主要成分为单萜烯类的β-蒎烯、α-蒎烯、β-石竹烯、3-蒈烯、柠檬烯等。Dosoky等[10]用水蒸气蒸馏法提取了6种马达加斯加黑胡椒精油和5种巴西黑胡椒精油，通过GC-MS分析出β-石竹烯、3-蒈烯、柠檬烯、β-蒎烯、α-蒎烯、桧烯为主要成分。

近年来，尽管已有众多学者对黑胡椒精油的化学成分进行研究，但对一些成分的定性仍然不够准确，因为对具有多个官能团的化学成分而言，质谱检索结果可能有多个高匹配度的化合物与之对应，仅依靠质谱检索结果外加人工辅助解析进行准确定性稍显不足，因为Kovats保留指数（KI） 一方面在色谱定性中重现性和准确度都很好，另一方面在区分同一化合物的不同同分异构体上具有明显优势，故本文在黑胡椒精油GC-MS化学成分研究的基础上，引入保留指数开展黑胡椒精油的定性分析。采用保留指数结合质谱标准谱库（NIST 17.L）检索的方式对水蒸气蒸馏法提取的海南产黑胡椒精油挥发性成分进行分析和鉴定，为进一步研究和开发黑胡椒精油提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

黑胡椒果：海南产，干燥果实，含水量＜8%，购于武汉市神草中药饮片有限责任公司。

1.2 试剂

无水乙醇、无水硫酸钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；正构烷烃C8～C20混合对照标准品（色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司。

1.3 主要仪器与设备

8890-5977B型气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；98-1-B型电加热套 天津市泰斯特仪器有限公司；圆底烧瓶、冷凝管、油水分离器等实验室常规玻璃仪器 四川蜀牛玻璃仪器有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 黑胡椒精油的提取

称取黑胡椒果样品300 g置于5 000 mL圆底烧瓶中，按照料液比1∶10加入去离子水浸泡3～4 h，用水蒸气蒸馏6 h，至油水分离器的量柱中精油量基本不再增加时停止加热。冷却后，打开量柱下端的阀门，将下层水分缓慢放出，收集上层精油部分，得到具有浓郁辛香韵的淡黄色澄清液体。然后用无水硫酸钠去除水分，得到黑胡椒精油，取 1.0 μL用无水乙醇稀释后供GC-MS分析。

1.4.2 GC-MS分析条件[11]

色谱条件：DB-5毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气（He）流速为1 mL/min，进样量为1 μL；分流比为50∶1；进样口温度为250 ℃；升温程序：60 ℃保持1 min，以4 ℃/min升温至240 ℃，再以10 ℃/min升温至280 ℃，保持5 min。

质谱条件：电子轰击（EI）离子源，电子能量70 eV；离子源温度280 ℃；传输线温度250 ℃；溶剂延迟时间3 min；质量扫描范围（m/z）：40～550 amu。

1.4.3 KI值的计算[12]

根据上述的GC-MS条件分析正构烷烃的混合对照标准品，记录其保留时间；按照线性升温程序的保留指数KI的计算公式，计算黑胡椒精油各挥发性成分的KI值，与NIST Chemistry WebBook网站数据库中的KI*值进行比对，可接受误差不超过3%。

2 结果与分析

2.1 黑胡椒精油挥发性成分分析

开展GC-MS分析提取得到黑胡椒精油的挥发性成分，精油总离子流图见图1。

采用峰面积归一化法，通过黑胡椒精油挥发性成分总离子流图来计算各成分的相对含量，对相对含量大于0.1%的成分进行定性分析。各色谱峰质谱匹配度较高的可能物质，通过所得的计算值KI与检索其文献值KI*二者接近度最高为准，具体结果见表1。

由图1和表1可知，通过GC-MS分析黑胡椒精油，再在此基础上对保留指数KI进行定性分析，从黑胡椒精油挥发性成分中共鉴定出主要成分27种，占精油总挥发性成分的99.18%，以烯烃类为主。其中，烯烃类19种，占比88.95%；醇类6种，占比7.04%；酮类1种，占比0.18%；其他类1种，占比3.01%。

2.2 保留指数准确定性黑胡椒精油的挥发性成分

基于GC-MS分析，采用保留指数对黑胡椒精油挥发性成分进行充分定性，这种组合的分析方法较以往单独使用GC-MS的NIST 17.L标准谱库检索分析更加准确。在精油成分分析中，有一个明显的色谱峰，其保留时间为17.182 min，通过NIST 17.L标准谱库检索，得到两个具有90%以上相似度的化合物，为杜松烯的同分异构体，分别是δ-杜松烯（KI*值为1 524[13]）、β-杜松烯（KI*值为1 472[14]），而通过计算得到符合此色谱峰的化合物保留指数KI值为1 525，故可鉴定此化合物为δ-杜松烯。

在精油成分分析中保留时间为8.403 min时的色谱峰，由质谱定性分析可知为右旋柠檬烯和柠檬烯，计算得出保留指数KI值为1 030，通过查阅的保留指数KI*值为1 033 [15]，而右旋柠檬烯的保留指数KI*值未能查出。虽二者在黑胡椒精油文献中均有报道[6-10]，但定性为柠檬烯的文献较多，结合保留指数分析，故可将保留时间为8.403 min的色谱峰所对应的化合物鉴定为柠檬烯。

在精油成分分析中保留时间为9.548 min和9.596 min时的色谱峰，由质谱定性分析可知为Cyclohexene，3-methyl-6-（1-methylethylidene）-（萜品油烯）和Cyclohexene， 1-methyl-4-（1-methylethylidene）-（萜品油烯），二者的保留指数KI*值分别为1 083[16]，1 089[17]，故保留时间为9.548 min的色谱峰所对应的化合物鉴定為Cyclohexene，3-methyl-6-（1-methylethylidene）-（萜品油烯），而9.596 min的色谱峰所对应的化合物鉴定为Cyclohexene，1-methyl-4-（1-methylethylidene）-（萜品油烯）。

另外，在精油成分分析中保留时间为11.781 min时的色谱峰，由质谱定性分析可知为顺式香桧醇，根据实测保留指数KI值为1 216，而文献保留指数KI*值为1 143[18]，二者数值差异达到5%以上。根据同一组分析中保留指数随保留时间的增加而递增的规律，顺式香桧醇的保留指数KI*值为1 143，小于出峰时间更早的对甲基苯异丙醇、α-松油醇的保留指数KI*值（见表1），似乎不符合为这个色谱峰的化合物。但是，质谱分析顺式香桧醇的匹配度高达91%，且也在段梦雅等[7]报道的黑胡椒精油中存在，挥发性成分分析的出峰时间也介于α-松油醇和δ-榄香烯二者出峰时间之间，同本文分析结果一致，因此可鉴定为顺式香桧醇，其文献保留指数KI*值为1 143，值得商榷，也有待于后续学者开展黑胡椒精油中这一化合物鉴定的相关研究。

在精油成分分析中保留时间为8.317 min时的色谱峰，由质谱定性分析可知为邻伞花烃、间伞花烃或对伞花烃，三者互为同分异构体，经比对保留指数文献可知，3个互为同分异构体的化合物的保留指数KI*值十分接近，分别为1 022，1 026，1 024（见表2），根据实测保留指数KI值为1 025，为邻伞花烃的概率最小，但也无法鉴定是间伞花烃还是对伞花烃。由表2可知，3种化合物均报道存在于黑胡椒精油中，可能是因为黑胡椒精油原料的品种、产地的土壤和气候、收获期等因素的影响，各产地或品种的黑胡椒精油成分中含有的伞花烃（cymene）结构不同。而在Al-Sayed等[9]、Dosoky等[10]报道的黑胡椒精油中，结合保留指数进行了挥发性成分分析，伞花烃基本以对伞花烃结构存在，即使存在二种或二种以上结构的伞花烃，也是以对伞花烃为主要组分。再结合本文选取相对含量大于0.1％的化学成分进行分析的先决条件，综合黑胡椒精油文献报道和保留指数分析，此色谱峰的化合物定性为对伞花烃的概率较大，该色谱峰的化合物最终可鉴定为对伞花烃。

3 结论

在质谱的定性分析结果中，从概率上看保留指數和质谱图均一致的挥发性成分出现的频率较低，因此采用保留指数分析同分异构体具有特殊的优势，在食品、油脂等定性工作中是十分重要的辅助方法[11]。但是，保留指数在挥发性成分定性分析中也存在些许不足，特别是在挥发性成分的多个同分异构体的KI*值较接近的条件下，也需要借助人工解析等进行定性，如本研究中黑胡椒精油中伞花烃的定性。

同时采用保留指数与NIST 17.L标准谱库检索对黑胡椒精油挥发性成分进行了准确定性，相对含量较高的组分为β-石竹烯23.91%、3-蒈烯19.30%、柠檬烯17.23%、β-蒎烯7.83%、异桉叶油醇4.25%和石竹烯氧化物3.01%。黑胡椒精油中β-石竹烯的含量居首位，与王珏等[6]、侯冬岩等[8]和王花俊等[23]的研究结果一致，也有相关文献报道3-蒈烯的含量居首位，基本上β-石竹烯和3-蒈烯的含量在黑胡椒精油中居前两位。

在黑胡椒精油中已鉴定的27种组分中26种是由保留指数结合标准谱库检索结果鉴定得到的，特别是δ-杜松烯、柠檬烯、Cyclohexene，3-methyl-6-（1-methylethylidene）-（萜品油烯）、Cyclohexene，1-methyl-4-（1-methylethylidene）-（萜品油烯）、对伞花烃等的鉴定，其分析结果比仅使用谱库检索的方式更准确。

参考文献：

[1]SALEHI B， ZAKARIA Z， GYAWALI R， et al. Piper species： a comprehensive review on their phytochemistry，biological activities and applications[J].Molecules，2019，24（7）：1364.

[2]于岚，郝正一，胡晓璐，等.胡椒的化学成分与药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2020，26（6）：234-242.

[3]常红，毕耀，王颖，等.黑胡椒精油复合涂层对金华火腿理化特性及食用品质安全的影响[J].食品科学，2020，41（13）：193-198.

[4]ZAHIN M， BOKHARI N， AHMAD I， et al. Antioxidant， antibacterial， and antimutagenic activity of Piper nigrum seeds extracts[J].Saudi Journal of Biological Sciences，2021，28（9）：5094-5105.

[5]徐可文，阚海峰，杜宏金.黑胡椒挥发油的FTIR鉴定与GC-MS分析[J].现代中药研究与实践，2011，25（3）：28-30.

[6]王珏，钟壹鸣，孙也乔，等.3种不同萃取方法对黑胡椒香气物质的气质联用分析[J].热带作物学报，2022，43（5）：1055-1063.

[7]段梦雅，王福清，吴桂苹，等.4种胡椒精油风味特征分析[J].食品科学，2022，43（8）：213-219.

[8]侯冬岩，回瑞华，李铁纯，等.海南黑胡椒果挥发性成分气相色谱-质谱分析[J].质谱学报，2005，26（1）：40-42.

[9]AL-SAYED E， GAD H， KERSH D. Characterization of four Piper essential oils （GC/MS and ATR-IR） coupled to chemometrics and their anti-Helicobacter pylori activity[J].ACS Omega，2021，6（39）：25652-25663.

[10]DOSOKY N， SATYAL P， BARATA L， et al.Volatiles of black pepper fruits （Piper nigrum L.）[J].Molecules，2019，24（23）：4244.

[11]董世良，陈一，刘冰，等.万寿菊油挥发性成分的GC-MS保留指数定性分析[J].食品研究与开发，2018，39（20）：152-156.

[12]叶洵，刘子博，张婷，等.基于GC-MS结合保留指数法建立花椒挥发油指纹图谱[J].中国调味品，2022，47（4）：68-73.

[13]CHAMALI S， BOUAJILA J， DAOUD H， et al. Variation in chemical composition and biological properties of two Tunisian Eucalyptus essential oils under three eco-friendly extraction techniques[J].Journal of Essential Oil Research， 2022，34（1）：36-53.

[14]SILVA M， ANDRADE E， ZOGHBI M， et al. The essential oils of Lantana camara L. occurring in North Brazil[J]. Flavour and Fragrance Journal，1999，14（4）：208-210.

[15]BARBOSA L， PAULA V， AZEVEDO A S， et al. Essential oil composition from some plant parts of Conyza bonariensis （L.） Cronquist[J].Flavour and Fragrance Journal，2005，20（1）：39-41.

[16]MAIA J， SILVA M， ANDRADE E， et al. Essential oils from Astronium urundeuva （Allemao） Engl. and A. fraxinifolium Schott ex Spreng.[J].Flavour and Fragrance Journal，2002，17（1）：72-74.

[17]FLAMINI G， CIONI P， MORELLI I， et al. Essential oils of the aerial parts of three Salvia species from Jordan： Salvia lanigera， S. spinosa and S. syriaca[J].Food Chemistry，2007，100（2）：732-735.

[18]ADAMS R R.Systematics of Juniperus section Juniperus based on leaf essential oils and random amplified polymorphic DNAs （RAPDs）[J].Biochemical Systematics and Ecology，2000，28（6）：515-528.

[19]TELASCREA M， ARAUJO C， MARQUES M， et al. Essential oil from leaves of Cryptocarya mandioccana Meisner （Lauraceae）：composition and intraspecific chemical variability[J].Biochemical Systematics and Ecology，2007，35（4）：222-232.

[20]GOMEZ E， LEDHETTER C， HARTSELL P. Volatile compounds inapricot， plum， and their interspecific hyhrids[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1993，41（10）：1669-1676.

[21]KABIR Y， AKASAKA-HASHIMOTO Y， KUBOTA K， et al. Volatile compounds of black cumin （Nigella sativa L.） seeds cultivated in Bangladesh and India[J].Heliyon，2020，6（10）：5343.

[22]彭志宏，豆海港.GC-MS分析同時蒸馏-萃取（SDE）黑胡椒挥发性成分[J].中国调味品，2011，36（6）：90-92.

[23]王花俊，齐海英，张峻松.黑胡椒精油挥发性成分分析[J].中国调味品，2017，42（12）：138-140.