生物保鲜剂对气调包装盐水鹅制品品质的影响研究

曾玉祥 沈海军 曹仲文

摘要：针对地方特色美食扬州盐水鹅易腐性高、不耐保藏的现状，研究复合生物保鲜剂对气调包装盐水鹅制品品质的影响。在4 ℃的条件下对N2气调包装盐水鹅做破坏性试验，分离鉴定其残存的微生物菌群，检测出的代表性菌株有荧光假单胞菌、产气肠杆菌、消化乳杆菌、热杀索丝菌和腐生葡萄球菌。以Nisin（乳酸链球菌素）、壳聚糖（chitosan）、丁香提取物（clove extract）3种生物保鲜剂为指标进行单因素抑菌试验，根据单因素试验结果，对3种保鲜剂进行复配试验，经Box-Behnken design（BBD）与响应面优化，测其TVB-N值。结果表明，最优复合保鲜剂组合为Nisin 0.03%+壳聚糖0.42%+丁香提取物2.40%，曲面极值点TVB-N最小值为12.47 mg/100 g。该试验为气调包装盐水鹅制品保鲜技术的应用研究提供了理论基础。

关键词：盐水鹅；气调包装；腐败菌；复合保鲜剂

中图分类号：TS206.1      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2024）04-0186-06

Stndy on the Effect of Biological Preservatives on the Quality of

Modified Atmosphere Packaged Salted Goose Products

ZENG Yu-xiang1， SHEN Hai-jun1，2， CAO Zhong-wen2，3*

（1.School Point of Yangzhou Tourism and Business School， Jiangsu Union Technical Institute，

Yangzhou 225001， China; 2.Key Laboratory of Chinese Cuisine Intangible Cultural Heritage

Technology Inheritance， Ministry of Culture and Tourism， Yangzhou 225127， China;

3.School of Tourism and Cuisine， Yangzhou University， Yangzhou 225127， China）

Abstract： In response to the high perishability and poor storage resistance of Yangzhou salted goose， a local specialty food， the effect of composite biological preservatives on the quality of modified atmosphere packaged salted goose products is studied. Destructive test is conducted on N2 modified atmosphere packaged salted goose under 4 ℃ conditions， and residual microbial groups are isolated and identified. The representative strains are Pseudomonas fluorescens， Enterobacter aerogenes， Lactobacillus alimentarius， Brochothrix thermosphacta and Staphylococcus sarophyticus. With three preservatives， namely Nisin， chitosan and clove extract， as the indexes， single factor antibacterial test is carried out. Based on the single factor test results， composite test is conducted on the three preservatives， and through Box-Behnken design （BBD） and response surface optimization， TVB-N values are measured. The results show that the optimal composite preservative combination is Nisin 0.03%+chitosan 0.42%+clove extract 2.40%， and the minimum TVB-N value of the surface extreme point is 12.47 mg/100 g. This test has provided a theoretical basis for the application and study of preservation techniques for modified atmosphere packaged salted goose products.

Key words： salted goose; modified atmosphere packaging; spoilage bacteria; composite preservatives

收稿日期：2023-11-26

基金項目：教育部人文社会科学研究一般项目（17YJAZH006）；四川省高等学校重点实验室开放基金项目（PRKX201911）

作者简介：曾玉祥（1972—），男，高级讲师，硕士，研究方向：食品开发、烹饪工艺标准化。

*通信作者：曹仲文（1973—），男，副教授，博士，研究方向：轻工技术与工程及传统烹饪产业化。

盐水鹅是经各种香料卤制而成的鹅肉制品，属江苏扬州与周边地区的传统特色风味食品。其肉质细嫩、口味鲜美、肥而不腻、营养丰富，深受消费者喜爱[1—2]。但由于盐水鹅具有较高的含水量和丰富的营养物质，为微生物的生长繁殖提供了有利的条件，在销售和运输过程中易受杂菌污染，导致其品质降低，严重制约了其销售范围[3—4]。研究其相关的保鲜技术对延长盐水鹅的货架期、保证其食品安全、减少营养损失等具有重要意义[5]。目前扬州市面上盐水鹅包装制品大多为真空包装，已有学者对真空包装的盐水鹅进行研究，发现其制品中仍有一定的残存菌群。董洋等[4]利用传统平板培养结合聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术对其加工过程中微生物菌群的多样性进行了分析，研究得出真空包装的盐水鹅产品中的腐败菌主要为莓实假单胞菌和魏斯氏菌。周涛等[6]根据染色镜检、生理生化试验研究得出导致盐水鹅腐败变质的主要微生物为荧光假单胞菌和成团泛菌。王虎虎等[7]研究发现在4 ℃的条件下，盐水鹅包装品的优势腐败菌为铜绿假单胞菌。相较于传统的普通包装，虽然真空包装具有进一步阻止细菌滋生、延长保质期的优点[8]，但是真空包装的盐水鹅制品的肉质过于紧密，使其失去原本细腻的口感。气调包装（modified atmosphere packaging，MAP）制品具有可以改变菌相构成、抑制优势腐败菌繁殖的优点[9]，且经过气调包装的制品口感与新鲜制品相近，因此气调包装逐渐被看好，但尚未见盐水鹅菌相构成及配套保鲜技术方面的研究。

生物保鲜剂是天然物质，通常来源于动物、植物或微生物的新陈代谢产物，具有天然、安全、无毒的优点，通过浸泡、喷淋或涂抹等方式应用于食品中，从而达到防腐保鲜的效果[10]。常用的保鲜剂有乳酸链球菌素（Nisin）、壳聚糖、曲酸、纳他霉素、茶多酚、丁香提取物等。筛选出适合的保鲜剂及最佳配比有望实现延长盐水鹅货架期的目的。

为了探究不同生物保鲜剂对盐水鹅气调包装制品品质的影响，本文以扬州市售盐水鹅为研究对象，在贮藏温度为4 ℃的条件下，对其N2气调包装盐水鹅样品做破坏性试验，采用选择性培养基进行菌相分析，保藏5 d后，对培养物中的代表性菌株进行分离纯化和16S rDNA测序鉴定，确定菌种。依据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》，以Nisin、壳聚糖、丁香提取物3种生物保鲜剂为考察因素进行单因素试验，经BBD（Box-Behnken design）与响应面优化，得出最佳配比，以期为气调包装盐水鹅制品的保鲜技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

光鹅（当天宰杀，约1 200 g）、生姜、香葱、花椒、食盐、黄酒、胡椒粉、味精、香油、香叶等：购于扬州大润发超市；25 cm×35 cm PA/PE复合光面透明包装袋：扬州南方仪器设备化工有限公司；纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司。菌株鉴定试剂：Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、SanPrep 柱式DNA胶回收试剂盒、Taq DNA聚合酶、PCR产物纯化试剂盒、细菌DNA提取试剂盒：均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。Nisin（食品级）、壳聚糖（食品级）：上海蓝季生物科技有限公司；丁香提取物（食品級）：西安瑞迪生物科技有限公司。

2720 Thermal Cycler型PCR仪 美国应用生物系统公司；HC-2518R型高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；QYC-200型全温培养摇床 上海新苗医疗器械制造有限公司；YX280B型手提式压力蒸汽灭菌器 上海三申医疗器械有限公司；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司；DT-200型电子天平 常熟市双杰测试仪器厂；HH-8型数显恒温水浴锅 杭州同华电器有限公司；HSX-250型恒温恒湿培养箱 上海福玛实验设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的制备

盐水鹅样品的制备：鹅用冷水浸泡30 min去血水→加入生姜8 g、香葱10 g，煮制30 min→洗净→加入香叶、食盐腌制4 h→加入葱段10 g、姜片7 g、黄酒适量、胡椒粉适量和腌制好的鹅于碗中→上屉蒸50 min→冷却后加入味精、香油于卤汁中→成品。

气调包装盐水鹅样品的制备：充入100% N2，充气时间15 s，加热时间5 s，加热温度60 ℃，总压力5 MPa，于15 ℃放置，做破坏性试验，分离菌群。将盐水鹅以25 g为基本单元，用复合保鲜剂浸泡5 min，沥干10 min，作N2气调包装，置于4 ℃条件下，保藏5 d，序时检测，对盐水鹅进行菌落总数的序时测定，并对各类菌作分类计数，统计占比（%）。

1.2.2 培养基的制备

营养琼脂培养基、MSA培养基、MRS培养基、STAA培养基、VRBGA培养基、Pseudomonades培养基，按文献[11]进行配制。

1.2.3 代表性菌株的鉴定

对培养物中的代表性菌株进行分离提纯和16S rDNA测序鉴定，确定菌名。基因组DNA提取：采用细菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA。目标片段PCR扩增：参考赖宏刚[12]的方法提取基因组DNA、PCR循环条件、凝胶电泳、纯化回收。系统发育树构建：将所测序列在NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中使用BLAST程序在GenBank数据库进行同源性比较，获得最相似典型菌的DNA序列，构建系统发育树。

1.2.4 TVB-N值的测定

TVB-N值的测定及样品的处理参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[13]。每个样品测试3次，取其平均值为最终结果。

1.2.5 保鲜剂单因素试验

参照GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[14]，在肉类样品中壳聚糖的最大用量为6 g/kg，Nisin的最大用量为0.5 g/kg，由于天然香辛料提取物安全性较高，标准中未规定其最大用量，依据聂相珍[15]的研究结果，确定丁香提取物最大浓度为6%。将Nisin、壳聚糖、丁香提取物按表1设置不同浓度，做单因素试验。

1.2.6 响应面优化试验设计

根据单因素试验结果，运用Design Expert 13进行响应面试验，对Nisin、壳聚糖和丁香提取物进行复配设计，将复合保鲜剂添加到盐水鹅中，测定TVB-N值，通过回归方程的构建拟合因素与响应值之间的函数关系，得到保鲜效果最佳的变量组合。

1.3 数据分析

运用Mega 7.0软件进行系统发育树的构建，BLAST软件对基因序列进行比对分析，SPSS 24.0软件进行数据处理，Origin软件进行绘图，Design Expert 13软件进行响应面优化试验设计。

2 结果与分析

2.1 盐水鹅N2气调包装制品的菌相构成

经N2气调包装的盐水鹅在4 ℃下保藏5 d后，从选择性培养基上挑取典型生长菌落，在其相应的平板上划线分离，分离纯化2～3次，得到纯化的单菌落[16]，通过观察其菌落形态、生理生化试验和16S rDNA鉴定，其菌相构成见表2。

由表2可知，各菌株占比以假单胞菌（52.30%）和肠杆菌（31.09%）为主，占比达到菌落总数的83.39%，剩余腐败菌分别为热杀索丝菌（12.40%）、乳酸菌（2.69%）、球菌（1.50%）。以上结果表明，在贮藏条件下盐水鹅的腐败优势菌为假单胞菌和肠杆菌。代表性菌株系统发育树见图1，菌株分别标记为J、C、S、R、P。

2.2 盐水鹅N2气调包装制品的代表性菌株鉴定结果

根据《伯杰细菌鉴定手册》[17]与《常见细菌系统鉴定手册》[18]，用BLAST软件将5个菌株（假单胞菌、肠杆菌、热杀索丝菌、乳酸菌、球菌）的16S rDNA序列与GenBank中已知序列进行比对分析，选取同源性较高的菌株序列构建系统发育树，结果见表3和图1。

由表3和图1可知，J与假单胞菌属的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）同源性最高，相似性为99%；C与肠杆菌科的产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）同源性最高，相似性为97%；S与索丝菌属的热杀索丝菌（Brochothrix thermosphacta）同源性最高，相似性为99%；R与乳酸菌属的消化乳杆菌（Lactobacillus alimentarius）同源性最高，相似性为92%；P与葡萄球菌属的腐生葡萄球菌（Staphylococcus sarophyticus）同源性最高，相似性为98%。根据已知腐败代表性菌株，进一步为盐水鹅的保鲜技术提供了理论依据。

2.3 盐水鹅N2气调包装制品保鲜剂单因素试验结果

3种生物保鲜剂的单因素抑菌试验结果见表4，空白组中各抑菌圈均为8.0 mm。

由表4可知，当Nisin浓度范围为0.03%～0.05%时，随着乳酸链球菌素浓度的增加，其对R、P、S的抑制作用逐渐增强，J、C的抑菌圈无明显变化，因此，可将此Nisin浓度范围用于复配。当壳聚糖浓度范围为0.36%～0.60%時，随着壳聚糖浓度的增加，其对J和C的抑制作用逐渐增强，同时R的抑菌圈逐渐扩大，但扩大速度较慢，而P和S的抑菌圈无明显变化。因此，壳聚糖的浓度范围为0.36%～0.60%时可用于复配。当丁香提取物浓度范围为3.6%～6.0%时，随着丁香提取物浓度的增加，其对J、C、R、P、S 5种代表性菌株均有抑制作用，特别对J、R和P的抑制作用较强。因此，丁香提取物浓度范围为3.6%～6.0%时抑制作用最强，可用于复配。

2.4 盐水鹅保鲜剂BBD与响应面优化

根据单因素试验结果，运用Design Expert 13对Nisin、壳聚糖和丁香提取物进行复配试验，并将复合保鲜剂添加于盐水鹅中，于4 ℃条件下保藏3 d，测其TVB-N值，结果见表5。

对表5中的数据进行回归拟合，得到盐水鹅的TVB-N值与Nisin、壳聚糖和丁香提取物3个因素之间的二次方程：TVB-N=11.28+0.67A+0.68B+0.15C－0.78AB－0.013AC－0.40BC+0.41A2+1.14B2+0.12C2，可知盐水鹅复合保鲜剂的最佳添加量为Nisin 0.03%、壳聚糖0.42%、丁香提取物2.40%，在此复配组合下，盐水鹅的TVB-N值较小，预测值为10.23 mg/100 g。实际测得TVB-N值为12.47 mg/100 g，与预测值基本相符，表明优化后的回归方程能较好地预测各因素与TVB-N值之间的关系，该复配工艺具有实际应用价值。对该模型进行方差分析，结果见表6。

由表6可知，该模型具有极显著性差异（P＜0.01），且决定系数R2为0.986 1，说明该模型非常适合拟合试验结果[19]。失拟项不显著（P>0.05），表明模型误差较小。校正决定系数RAdj2为0.968 1，表明模型在相关性和解释能力方面表现出色，可用于理论分析和预测。

F值是评价各变量对响应值影响程度的重要指标。较大的F值表示模型分项对响应值的贡献度较高。当显著性检验概率P＜0.05时，表明该变量对响应值的影响显著，并且具有统计学上的意义。分析各因素对TVB-N值的影响可知，一次项Nisin浓度（A）、壳聚糖浓度（B）对TVB-N值的影响极显著（P＜0.01），3个影响因素中，对TVB-N值的影响程度为B＞A＞C，即壳聚糖浓度＞Nisin浓度＞丁香提取物浓度。二次项A2、B2对TVB-N值的影响极显著（P＜0.01），说明这两个因素对模糊数学感官评分具有非线性的影响。交互项AB、BC对TVB-N值的影响极显著（P＜0.01）。

2.5 响应面交互作用分析

为研究各因素之间的交互作用，采用Design-Expert 13软件绘制了响应面图包括3D图形和等高线图。图形的坡度越大表示对试验结果的影响越显著。观察3D响应面图能够直观地揭示各因素之间的交互作用对TVB-N值的影响，确定最佳工艺参数以及参数之间的相互作用。响应面分析结果见图2～图4。

Nisin浓度和壳聚糖浓度对盐水鹅样品TVB-N值的交互作用见图2。

由图2可知，等高线呈椭圆形，表示两因素的交互作用显著，响应面图表示盐水鹅的TVB-N值随着Nisin浓度和壳聚糖浓度的增加呈先减少后缓慢增加的趋势。

壳聚糖浓度和丁香提取物浓度对盐水鹅样品TVB-N值的交互作用见图3。

由图3可知，等高线呈椭圆形，表示两因素的交互作用显著，响应面图表示盐水鹅的TVB-N值随着壳聚糖浓度和丁香提取物浓度的增加呈先减少后缓慢增加的趋势。

Nisin浓度和丁香提取物浓度对盐水鹅样品TVB-N值的交互作用见图4。

由图4可知，在试验范围内，响应面图表示盐水鹅的TVB-N值随着Nisin浓度和丁香提取物浓度的增加呈先减少后缓慢增加的趋势。

2.6 最优工艺及验证试验结果

以TVB-N最小值为优化目标，用Design-Expert 13软件对试验进行优化设计，得到的TVB-N值较小，预测值为10.23 mg/100 g。此时3个因素的预测值分别为Nisin浓度0.03%、壳聚糖浓度0.42%、丁香提取物浓度2.40%，为了确定该模型的准确性，采用优化后的参数进行验证试验，为方便操作，条件参数设为Nisin浓度0.03%、壳聚糖浓度0.42%、丁香提取物浓度2.40%，平行3次试验取平均值，测得TVB-N值为12.47 mg/100 g，与试验数据基本相符，与模型预测值12.08 mg/100 g在5%偏差范围内，说明优化后的回归方程模型可以用于实践。

3 结论

本研究以气调包装盐水鹅制品为试验对象，对其进行破坏性试验，以被检出的气调包装盐水鹅制品中的代表性菌株为受试菌株，通过单因素试验得出Nisin对R、S、P有较好的抑菌作用；壳聚糖对J、C有较好的抑菌作用；丁香提取物对J、R、P有较好的抑菌作用。利用MAP技术进行综合保鲜，筛选出最佳复配保鲜剂，通过Design-Expert 13软件对数据进行回归拟合，得出盐水鹅最优复合保鲜剂组合为Nisin 0.03%+壳聚糖0.42%+丁香提取物2.40%，盐水鹅样品的曲面极值点TVB-N值的最小值为12.47 mg/100 g。本研究为该保鲜技术的研究应用提供了基础，同时为提高盐水鹅的品质、扩大盐水鹅的销售市场、推进盐水鹅产业化提供了一定的指导意义。

参考文献：

[1]沈晖.扬州鹅煲汤过程中固形物含量的变化分析[J].美食研究，2018，34（4）：49-52.

[2]钱翔羽，于海，葛庆丰，等.扬州市售盐水鹅品质分析[J].中国调味品，2018，43（7）：126-130.

[3]要志宏.扬州盐水鹅危害因子识别及风险评估[D].扬州：扬州大学，2018.

[4]董洋，王虎虎，闫振国，等.真空包装盐水鹅加工过程中微生物污染状况与菌群多样性研究[J].南京农业大学学报，2012，35（3）：121-126.

[5]张元嵩，蒋云升，崔杨晨，等.气调包装盐水鹅优势菌的初步研究[J].现代食品，2018（21）：192-197.

[6]周涛，余娟，毛杨敏.真空包装盐水鹅中腐败细菌的分离鉴定[J].食品工业科技，2016，37（14）：219-222.

[7]王虎虎，董洋，李诺，等.真空包装盐水鹅贮藏期菌群多样性动态分析[J].中国食品学报，2017，17（4）：258-264.

[8]刘少伟.真空包装食品≠绝对安全[J].大众健康，2020（6）：84-85.

[9]姚尧，毕晓彤，白鸽，等.包装方式对冷鲜鸡肉贮藏品质的影响[J].食品科技，2018，43（9）：152-157.

[10]杨焕彬，曾庆培，林光明，等.生物保鲜剂在禽肉保鲜中的应用研究进展[J].轻工学报，2021，36（6）：38-46.

[11]刘慧.现代食品微生物学实验技术[M].北京：中国轻工业出版社，2017：260-268.

[12]赖宏刚.真空包装冷鲜鸡中代表株微生物的分离鉴定[J].江苏农业科学，2018，46（17）：198-201.

[13]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定：GB 5009.228—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[14]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品添加剂使用标准：GB 2760—2014[S].北京：中国标准出版社，2014.

[15]聂相珍.雪菜肉丝盖浇方便面浇头的研制与营养卫生学评价[D].扬州：扬州大学，2017.

[16]要志宏，聂相珍，皇甫秋霞，等.真空包装雪菜肉丝的初始菌相分析与代表株的鉴定[J].中国调味品，2017，42（4）：1-3.

[17]R·E·布坎南，N·E·吉本斯.伯杰细菌鉴定手册（第八版）[M].北京：科學出版社，1995：591-611.

[18]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：364-370.

[19]卢珍兰，庞永慧，庞情，等.响应面法优化百香果果醋澄清的酶解工艺[J].中国调味品，2023，48（4）：137-142.