响应面分析优化晋西北酸粥和糜米总酚的提取工艺

王琪 彭佳伟

摘要：以總酚提取量为指标，研究自然发酵的晋西北酸粥和其原材料糜米中总酚的最佳提取工艺，采用福林酚比色法测定总酚提取量。比较不同的单因素对晋西北酸粥和糜米中总酚提取量的影响。在此基础上，通过响应面分析，探讨不同丙酮浓度、料液比、提取时间和提取温度对总酚提取量的影响。结果发现，晋西北酸粥中总酚的最佳提取条件为丙酮浓度58.06%、料液比1∶41.13、提取时间30.57 min和提取温度41.81 ℃，在此条件下总酚的最大提取量为1.88 mg/g。糜米中总酚的最佳提取条件为丙酮浓度84.78%、料液比1∶44.76、提取时间34.34 min、提取温度42.11 ℃，在此条件下总酚的最大提取量为1.51 mg/g，而且晋西北酸粥中总酚提取量约是糜米中总酚提取量的1.24倍。

关键词：晋西北酸粥；糜米；总酚；响应面实验优化

中图分类号：TS201.2      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2024）04-0127-07

Optimization of Extraction Process of Total Phenols from Sour Porridge in

Northwestern Shanxi and Milled Nonglutinous Broomcorn Millet

by Response Surface Analysis

WANG Qi， PENG Jia-wei

（School of Life Science， Shanxi University， Taiyuan 030031， China）

Abstract： The optimal extraction process of total phenols from naturally fermented sour porridge in northwestern Shanxi and its raw material milled nonglutinous broomcorn millet is studied with the extraction amount of total phenols as the index， and the extraction amount of total phenols is determined by Folin-Ciocalteu colorimetry. The effects of different single factors on the extraction amount of total phenols from sour porridge in northwestern Shanxi and milled nonglutinous broomcorn millet are compared. On this basis， the effects of different acetone concentrations， solid-liquid ratios， extraction time and extraction temperatures on the extraction amount of total phenols are  investigated by response surface analysis. The results show that the optimal extraction conditions of total phenols from sour porridge in northwestern Shanxi are as follows： acetone concentration is 58.06%， solid-liquid ratio is 1∶41.13， extraction time is 30.57 min and extraction temperature is 41.81 ℃.Under these conditions， the maximum extraction amount of total phenols is 1.88 mg/g.The optimal extraction conditions of total phenols from milled nonglutinous broomcorn millet are as follows： acetone concentration is 84.78%， solid-liquid ratio is 1∶44.76， extraction time is 34.34 min and extraction temperature is 42.11 ℃. Under these conditions， the maximum extraction amount of total phenols is 1.51 mg/g， and the extraction amount of total phenols from sour porridge in northwestern Shanxi is about 1.24 times that of milled nonglutinous broomcorn millet.

Key words： sour porridge in northwestern Shanxi; milled nonglutinous broomcorn millet; total phenols; optimization by response surface analysis

收稿日期：2023-12-13

基金项目：山西省自然科学基金面上项目（20210302123464）

作者简介：王琪（1982—），女，山西忻州人，讲师，博士，研究方向：微生物与功能食品。

糜米是北方地区的一种粮食，是糜子经脱壳加工成的初加工产品，不仅营养价值高，而且有一定的药用价值，是我国的传统中药材之一[1-2]。晋西北酸粥以糜米为原料，经室温自然发酵而成，风味独特，营养价值很高，因此深受当地人们的喜爱，在晋西北等地已成为主食之一[3]。有研究表明，以谷物为原料的食物中含有大量的多酚类化合物[4-7]，提高谷物中总多酚含量的有效方法之一是发酵[8]。截至目前，关于糜米发酵得到的晋西北酸粥和原料糜米中总酚含量的研究较少。

响应面分析（response surface analysis）是将数学方法和统计方法有机地结合在一起，可以建模和分析响应值受多个变量影响的问题，并最终对响应值进行优化的方法。它利用较少的实验量和时间对实验进行综合研究来解决多变量问题，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系[9-10]。

本实验根据Box-Behnken设计，在晋西北酸粥和糜米总酚提取工艺中，研究提取溶剂浓度、料液比、提取时间和提取温度及其交互作用对总酚提取量的影响。该结果不仅可以为提高晋西北酸粥的营养价值提供理论依据，而且可以为谷物发酵功能食品的开发提供参考思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

没食子酸、福林酚（Folin-Ciocalteu）、無水乙醇、甲醇、丙酮和无水碳酸钠：均为分析纯。

1.2 仪器与设备

752型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；SCJ-20型真空抽滤泵 上海知信实验仪器技术有限公司；JY92-ⅡN超声波细胞粉碎机、SB-5200DTDN超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；ZQTY-70振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司。

1.3 样品的制备

样品：糜米和糜米自然发酵后的晋西北酸粥均来自忻州市河曲县。将样品于50 ℃烘干、粉碎，过40目筛。每个样品重复测定3个。

1.4 标准曲线的制备[11]

将干燥至恒重的没食子酸10 mg用蒸馏水溶解，定容至50 mL，保存于棕色容量瓶中，即为标准溶液（0.2 mg/mL）。将其依次稀释成0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL梯度的稀释液。

取0.8 mL各梯度稀释液，分别与5.6 mL蒸馏水和0.4 mL福林酚试剂混匀。室温下静置6～8 min后再加入饱和碳酸钠溶液1.2 mL，混匀。暗处静置2 h后测定其在760 nm处的OD值，绘制标准曲线[12]。调零管用蒸馏水代替样品。

1.5 实验方法

1.5.1 不同提取方法对总酚提取量的影响

准确称取晋西北酸粥和糜米样品各0.5 g，按料液比1∶40加入80%乙醇后，分别用以下3种方法提取样品中的总酚：振荡提取（37 ℃、150 r/min、2 d）、超声波清洗机提取（25 ℃、50 kHz、50 min）和超声波细胞粉碎机提取（25 kHz、超声1 s停1 s、50 min）真空抽滤提取后的样品，滤液用80%乙醇定容至25 mL。采用福林酚法测定样品中总酚的提取量。

1.5.2 单因素实验

1.5.2.1 不同提取溶剂对总酚提取量的影响

准确称取晋西北酸粥和糜米样品各0.5 g，按料液比1∶40分别加入80%甲醇、80%乙醇、80%丙酮、蒸馏水和乙酸乙酯中，旋涡混匀。用超声波清洗机（50 kHz、37 ℃、50 min）提取样品中的总酚。提取结束后抽滤，定容至25 mL，测定总酚提取量。

1.5.2.2 不同浓度提取溶剂对总酚提取量的影响

准确称取晋西北酸粥和糜米样品各0.5 g，按料液比1∶40分别加入浓度为40%、50%、60%、70%、80%、90%的丙酮中，旋涡混匀。用超声波清洗机（50 kHz、37 ℃、50 min）提取样品中的总酚。提取结束后抽滤，定容至25 mL，测定总酚提取量。

1.5.2.3 不同料液比对总酚提取量的影响

准确称取晋西北酸粥和糜米样品各0.5 g，分别按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50向酸粥中加入60%丙酮，旋涡混匀；向糜米中加入80%丙酮，旋涡混匀。用超声波清洗机（50 kHz、37 ℃、50 min）提取样品中的总酚。提取结束后抽滤，定容至25 mL，测定总酚提取量。

1.5.2.4 不同提取时间对总酚提取量的影响

准确称取晋西北酸粥和糜米样品各0.5 g，按料液比1∶50向酸粥中加入60%丙酮，向糜米中加入80%丙酮，旋涡混匀。用超声波清洗机（50 kHz、37 ℃）分别提取10，20，30，40，50 min。提取结束后抽滤，定容至25 mL，测定总酚提取量。

1.5.2.5 不同提取温度对总酚提取量的影响

准确称取晋西北酸粥和糜米样品各0.5 g，按料液比1∶50向酸粥中加入60%丙酮，向糜米中加入80%丙酮，旋涡混匀。用超声波清洗机（50 kHz、50 min）分别于20，30，40，50，60 ℃下提取样品中的总酚。提取结束后抽滤，定容至25 mL，测定总酚提取量。

1.5.3 响应面分析优化晋西北酸粥和糜米中总酚的提取工艺

在单因素实验结果的基础上，采用Design-Expert 8.05b软件中的Box-Behnken Design方法[13]，以丙酮浓度、提取温度、料液比和提取时间为实验因素，以总酚提取量为响应值，进行响应面分析，因素和水平见表1和表2。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

根据没食子酸标准曲线得出标准曲线方程，由标准曲线方程计算总酚提取量，公式如下：

总酚提取量（mg/g）=（y-0.003 9）×50×1008.972 9×m×n。

式中：y表示吸光度；m表示样品的质量（g）；n表示测定用液体的体积（mL）。

2.2 单因素实验结果分析

根据1.5中实验方法进行实验，结果见图1。

超声波清洗机不但提取效果好，而且省时省力，晋西北酸粥和糜米中总酚提取量分别为1.676 mg/g和1.367 mg/g。因此，提取方法确定为超声波清洗机提取（50 kHz）。

通过比较甲醇、乙醇、丙酮、蒸馏水和乙酸乙酯5种溶剂的提取效果发现，丙酮提取的晋西北酸粥和糜米中总酚提取量最高，分别为1.825 mg/g和1.554 mg/g，所以选择丙酮为提取溶剂。

总酚的提取量随着丙酮浓度的上升均先升后降。当丙酮浓度为60%时，晋西北酸粥中总酚提取量最高（2.361 mg/g），而在80%丙酮溶液中糜米的总酚提取量最大（1.520 mg/g），这可能是由于发酵改变了糜米的性能和植物组分[14]，使酸粥的总酚在低浓度的丙酮溶液中就能被提取到。

随着料液比的增大，总酚的提取量逐渐增大。但当料液比大于1∶30时，总酚提取量不再明显增加，这可能是由于溶剂扩散达到了平衡。

当超声波提取40 min时，晋西北酸粥的总酚提取量最大（3.863 mg/g），继续提取总酚提取量反而降低，这可能是由于长时间的超声波对总酚结构造成了破坏。在超声波提取50 min時，糜米的总酚提取量最大（1.494 mg/g），与40 min的提取效果无显著差异（P>0.05）。

晋西北酸粥和糜米中的总酚都在50 ℃时提取量最大，再升高温度则总酚提取量降低，这可能是由于高温破坏了总酚的结构。

2.3 响应面实验结果分析

共设计了29个实验，采用Box-Behnken对晋西北酸粥的总酚提取量进行了分析，结果见表3。晋西北酸粥总酚提取回归模型方差分析结果见表4。

由表4可知，该模型的P值小于0.000 1，说明差异极显著；相关系数R2为0.865 2，说明实验误差较小；变异系数为5.24，说明该模型能较好地反映真实的实验值；失拟项的P值为0.010 7（P<0.05），说明实验误差较小，可用该模型推测实验结果。由P值可知，A、C、A2、B2、D2极显著影响酸粥的总酚提取量；B、D、AB、AC、AD、BC、BD、CD、C2对酸粥的总酚提取量无显著影响。综上，对晋西北酸粥中总酚提取量有影响的因素为丙酮浓度和料液比。晋西北酸粥中总酚提取量与各实验因素的回归方程为Y=221.85－10.99A－6.48B＋11.49C＋6.35D＋1.57AB＋2.49AC－5.23AD－0.495 7BC－8.18BD－3.53CD－24.63A2－12.96B2－2.79C2－22.63D2。

采用Box-Behnken对糜米总酚提取量的实验设计和结果见表5。糜米总酚提取回归模型方差分析结果见表6。

由表6可知，模型差异极显著（P<0.000 1），实验误差小（R2=0.967 7>0.9），可较好地反映真实的实验值（变异系数为3.85），实验结果和数学模型拟合良好（失拟项的F值为5.07，>0.1），故该模型可以用来推测实验结果。由P值可知A、C、A2、B2、D2对糜米总酚提取量的影响极显著；D、AD对糜米总酚提取量的影响显著；B、AB、AC、BC、BD、CD、C2对糜米总酚提取量的影响不显著，这与晋西北酸粥的实验结果有明显差异。对糜米总酚提取量有影响的因素为丙酮浓度、料液比和提取时间。糜米中总酚提取量与各实验因素的回归方程为Y=155.26＋18.86A＋1.11B＋15.45C＋4.03D－5.75AB－1.84AC＋6.79AD－1.65BC+1.39BD－1.79CD－22.23A2－11.08B2+1.75C2－21.44D2。

通过Design-Expert 8.05b软件可知各因素的交互作用下晋西北酸粥和糜米中总酚提取量，见图2。

由图2可知，对于晋西北酸粥而言，丙酮浓度与提取温度、丙酮浓度与料液比、丙酮浓度与提取时间、提取温度与料液比、提取温度与提取时间、料液比与提取时间的交互作用的响应曲面较平缓，说明这几个因素的交互作用对晋西北酸粥总酚提取量的影响微乎其微，这一结果与方差分析结果相吻合。在丙酮体积分数为58.06%、料液比为1∶41.13、提取时间为30.57 min和提取温度为41.81 ℃的条件下，晋西北酸粥总酚的提取量最大，为1.88 mg/g。

与晋西北酸粥不同，只有在丙酮浓度与提取时间交互作用时，对糜米的总酚提取量有显著影响；而其他因素的交互作用对糜米总酚提取量的作用微弱。在丙酮体积分数为84.78%、料液比为 1∶44.76、提取时间为34.34 min和提取温度为42.11 ℃的条件下，糜米总酚的提取量最大，为1.51 mg/g。经响应面分析优化提取条件后，晋西北酸粥总酚提取量约是糜米的1.24倍。

3 讨论

糜米是我国晋西北地区较常见的杂粮种类之一。徐元元等[15]将6种常见杂粮的抗氧化性与2种主粮的抗氧化性进行了对比，发现糜米中含有比大米和小麦更多的总酚。晋西北酸粥是将糜米自然发酵后得到的，含有一些功能性低聚糖、抗氧化活性成分、降胆固醇和降血压功效物质[16]。Kariluoto等[8]研究表明，发酵对谷物总多酚含量及其抗氧化活性具有提高作用。本实验表明糜米经发酵后总酚含量得到了提高。

采用响应面法对晋西北酸粥和糜米的总酚提取量进行优化后发现，丙酮浓度与料液比的交互作用对晋西北酸粥总酚提取量的影响较大。料液比对糜米总酚提取量的影响比对晋西北酸粥总酚提取量的影响大，这进一步证实了Katina等[14]的观点。不同溶剂和提取方法对晋西北酸粥和糜米总酚的提取量有明显的影响。所以，选择合适的溶剂和提取方法非常重要。

总酚含量较高的糜米经自然发酵后得到了总酚含量更高的晋西北酸粥，这可能是由于发酵改变了谷物中营养成分和抗营养成分的比例[17-18]。有研究表明，结合酚是谷物酚类化合物的主要存在形式[19-20]，可以通过酸、碱或酶处理释放[21]。而晋西北酸粥发酵过程中有众多酶系产生，促进了结合态酚类的释放，使其总酚含量增加，从而使晋西北酸粥具有抗氧化的物质基础，这为下一步开发具有保健作用的传统谷物食品提供了理论支撑。

参考文献：

[1]杨联芝，臧盛，高清菡，等.糜子皮壳中多酚物质的提取工艺研究[J].安徽农业科学，2010，38（21）：11482-11485.

[2]张丽珍，冯耐红，卫天业，等.糜米低醇饮料的研制[J].食品与发酵工业，2011，37（1）：111-113.

[3]薛建岗.内蒙古西部地区自然发酵酸粥化学成分及微生物组成分析[J].食品科技，2013，38（7）：10-16.

[4]赵国玲，刘承初.植物性食材的酚类化合物及其对机体的抗氧化保护[J].生物技术通报，2009（Z）：40-45.

[5]刘春丽，杨跃寰.荔枝果肉贮藏过程中酶促褐变物质的变化规律[J].江苏农业科学，2011，39（3）：355-356.

[6]贺佳，李多伟，智彩辉，等.茶叶有效成分综合提取分离生产工艺[J].江苏农业科学，2012，40（9）：247-250.

[7]肖凤艳，孙立彬.生地黄总多酚超声法提取工艺研究[J].江苏农业科学，2012，40（11）：294-295.

[8]KARILUOTO S， AITTAMAA M， KORHOLA M， et al. Effects of yeasts and bacteria on the levels of folates in rye sourdoughs[J].International Journal of Food Microbiology，2006，106（2）：137-143.

[9]BAS D， BOYACI I H. Modeling and optimization I： usability of response surface methodology[J].Journal of Food Engineering，2007，78（3）：836-845.

[10]郭雷，陈宇.响应面法优化超声辅助提取浒苔多糖的工艺[J].食品科学，2010，31（16）：117-121.

[11]李斌斌.利用芦笋老茎栽培姬松茸的研究[D].太原：山西大学，2011.

[12]DJERIDANE A， YOUSFI M， NADJEMI B， et al. Antioxidant activity of some Algerian medicinal plants extracts containing phenolic compounds[J].Food Chemistry，2006，97（4）：654-660.

[13]VOHRA A， SATYANARAYANA T. Statistical optimization of the medium components by response surface methodology to enhance phytase production by Pichia anomala[J].Process Biochemistry，2002，37（9）：999-1004.

[14]KATINA K， LIUKKONEN K H， KAUKOVIRTA-NORJA A， et al. Fermentation-induced changes in the nutritional value of native or germinated rye[J].Journal of Cereal Science，2007，46：348-355.

[15]徐元元，国旭丹，贺丽霞，等.常见6种杂粮与2种主粮的抗氧化活性比较研究[J].食品科学，2012，33（7）：20-25.

[16]李玉珍，肖怀秋，兰立新.我國大米发酵食品研究进展[J].江苏调味副食品，2008，25（6）：33-37.

[17]HEINI R L， KATINA K， WILHELMSON A， et al. Relationship between sensory perception and flavour-active volatile compounds of germinated， sourdough fermented and native rye following the extrusion process[J].Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie，2003，36：533-545.

[18]KATINA K， LAITILA A， JUVONEN R， et al. Bran fermentation as a means to enhance technological properties and bioactivity of rye[J].Food Microbiology，2007，24：175-186.

[19]DYKES L， ROONEY L W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits[J].Cereal Foods World，2007，52（3）：105-111.

[20]VAHER M， MATSO K， LEVANDI T， et al. Phenolic compounds and the antioxidant activity of the bran， flour and whole grain of different wheat varieties[J].Procedia Chemistry，2010，2（1）：76-82.

[21]BARTOLOME B， GOMEZ-CORDOVES C. Barley spent grain： release of hydroxycinnamic acids （ferulic and p-coumaric acids） by commercial enzyme preparations[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，1999，79：435-439.