基于胆碱类低共熔溶剂高效提取香附总黄酮的研究

赵晓娟，胡律江*，郭晓秋，郭慧玲

(1.江西中医药大学附属医院 药学部；2.江西中医药大学 药学院，江西 南昌 330006)

香附是莎草科的多年生草本植物，是传统中药材。香附总黄酮是香附的有效成分，能够治疗糖尿病、降低血糖、稳定血脂及氧化应激反应。[1-2]目前，常规的有机提取溶剂对环境危害大、毒性强、生物降解性差，而超声提取法及回流提取法则伴有噪声大、费时长、处理量小、耗材大、提取率低、杂质多等缺点。[3]低共熔溶剂(DeepEutectic Solvent，DES)是由氢键供体(Hydrogen Bond Donor，HBD)和氢键受体(Hydrogen Bond Acceptor，HBA)组成的共晶混合物，常温下呈液态，与传统溶剂功能相近，并且具备化学稳定性好、不易燃、不挥发、成本低、原料易得、可重复利用、可生物降解、低毒或无毒性等优点。[4-5]本研究基于氯化胆碱类DES，旨在探索更绿色、经济、高效的提取技术，实现香附总黄酮的快速有效提取，以期促进香附的开发和利用。

1 材料和方法

1.1 原料

香附购于兰州市黄河药材市场，质量符合《中华人民共和国药典》规定，洗涤干燥，粉碎机粉碎，过40目筛的部分保存备用。

1.2 试剂及仪器

氯化胆碱(上海国药集团化学试剂公司，质量分数≥98 %)、乙二醇、丙三醇、1，2-丙二醇、1，4-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇(均购自上海国药集团化学试剂有限公司，质量分数>99.0 %)。

FW-400A中草药粉碎机、GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱、AG285型电子分析天平、Cascada I型超纯水机、ZCW-1101型酶标仪均购自Thermo公司。

1.3 实验方法

1.3.1 DES制备

以氯化胆碱为氢键供体，各与6种氢键受体按1∶2摩尔比混合，80℃水浴中加热搅拌，得到透明均匀液体，即为6种DES(见表1)。

1.3.2 香附总黄酮提取

取香附粉末2 g加入圆底烧瓶，与一定体积DES混匀，转移至恒温油浴锅，定温定时提取，经离心机3000 r/min离心30 min，取上清液，弃沉淀，得香附总黄酮粗提液。

1.3.3 香附总黄酮含量测定

参考Feng S等[6]的方法并稍加改动：移取标液0、0.32、0.64、0.96、1.28、1.6、1.92 mL，加水稀释至5 mL，加0.4 mL 5%的亚硝酸钠，6 min后加0.6 mL 10%的硝酸铝，再6 min后加2 mL 4%的氢氧化钠，5 min后再510 nm处测定吸光度。重复3次。

1.3.4 试验设计

以单因素试验及中心组合设计分析香附总黄酮提取最优组合。在单因素实验结果的基础上，确定水比例(A)、液固比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)4个独立变量，各变量有3个水平，并编码为+1、0和1分别代表高，中，低水平值，α=2用于评价操作变量对响应变量的影响，响应变量与所选择的变量可通过下列模型：其中y是预测的响应值，Xi、Xj、Xk指编码水平的设计变量，b0、bi、bii为截距、线性、二次回归系数，bij、bijk、biij为相互作用系数。

1.4 统计分析

方差分析中的F值检验，判定系数(R2)和失拟率判断模型。t检验和F检验评估回归系数的统计学意义、确定三阶多项式模型方程。模型的拟合度由回归系数R2表示。R2越接近1，模型更准确。

2 结果

2.1 DES类型对提取率的影响

受极性、黏度可调谐性及增溶能力等因素限制，基于氯化胆碱的DES提取化合物的提取率不同，不同类型的DES作用下，溶剂的扩散，溶解性，黏度不同，因此香附总黄酮的提取率也出现水平波动，见表2。

表2 DES类型对提取率的影响

2.2 DES配比对提取率的影响

将6种DES及3个氯化胆碱-HBD配比(1∶2、1∶4、1∶6 mol/mol)进行考察，加热搅拌提取，提取时间30 min，温度80.0℃，液固比为15 mL/g，以丙三醇为氢键受体的DES-4在配比为1∶4时香附总黄酮提取率高，后续以氯化胆碱-丙三醇配比1∶4的DES进行实验，见表3。

表3 DES配比对提取率的影响

2.3 DES水比例、提取温度、提取时间对提取率的影响

DES性能受水的影响，在水比例为30 %时，香附总黄酮的提取率达到最高，此后，随着水比例增加，香附总黄酮的提取率下降，在水比例为100 %时，香附总黄酮提取率最低；提取温度影响溶剂的扩散率及化合物的解吸率及溶解性，提取温度达80℃可见解吸率及溶解性相对平衡；当提取率为40 min时，香附总黄酮的提取率为最佳，超过40 min后，随时间增加，香附总黄酮的提取率下降，见图1。

图1 DES水比例、提取温度、提取时间对提取率的影响

2.4 中心组合设计实验设计与结果

水比例、液固比、提取温度、提取时间均影响香附总黄酮的提取率，见表4。

表4 中心组合设计实验设计与结果

2.5 回归模型方差分析及各因素效应结果

该模型具有统计学意义(F=551.25,P<0.001),且该模型具有较好的拟合性和较少的平均值变化(R2=0.998)，调整后的R2(Radj2=0.996)表明模型合理且预测能力较好(Rpred2=0.975)，见表5。

表5 回归模型方差分析及各因素效应结果

作为一种新型的离子液体，胆碱类低共熔溶剂具有相比于其他离子液体更为突出的特点，如低毒、生物可降解、价格低廉等。

3 讨论

本研究探讨了一种新型、经济适用的提取方法，即胆碱类低共熔溶剂法，胆碱类低共熔溶剂作为新兴的离子液体，相比与现有的其他类离子液体优点更加显著，即毒性较低、可降解、价格低廉等。[7-8]不同的DES用来提取药物的提取率不同，这受粘度、极性及组成等DES性质影响，因此，DES的构成成分及结构在提取率的不同中存在重要意义。在本研究中发现，氯化胆碱-丙三醇是最适用于香附总黄酮的提取溶剂，本研究采用单因素试验结合中心组合设计准确筛选出工艺参数，即摩尔比1∶2，含水量20 %，配比1∶4，水比例30 %，提取温度80℃，提取时间40 min，液固比为15 mL/g是香附总黄酮的最佳提取条件。经过系统的因素筛选和水平确定，采用中心组合设计进一步优化提高了提取效率且DES的提取方法是一种比传统提取方法更绿色和安全的提取方法，可实现香附总黄酮的快速有效提取，促进香附的开发和利用。