中药单体调控肌腱干细胞成骨分化促进腱骨愈合的研究进展*

杨 庆,汪小敏,杨超强,王宜灿,康天泰,张虎林

(1.甘肃中医药大学中医临床学院,甘肃 兰州 730000; 2.甘肃中医药大学附属医院北院骨科,甘肃 兰州 730000)

随着健身运动的普及,肌腱和韧带损伤变得十分常见。肌腱和韧带损伤位置广泛,以肩袖(rotator cuff,RC)、髌腱和跟腱为主[1]。一般情况下,临床对于RC和前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)附着点的损伤常采用手术重建的方式进行治疗。该手术通常是通过以肌腱为移植物将其插入骨隧道中以促进腱骨愈合。研究表明,RC修复术后和ACL重建术后平均再撕裂率分别为94%和11.7%[2-3];此外,腱骨愈合不良还会导致膝关节松弛、软骨和半月板损伤及创伤后骨关节炎等[4-6]。研究[7]表明,纤维软骨区的再生对于腱骨愈合十分重要。腱骨愈合的机制十分复杂,目前尚未完全阐明,肌腱-骨连接处新骨的生成是评价其愈合的主要指标。研究[8]表明,通过种植间充质干细胞成骨分化可有效促进腱骨愈合。间充质干细胞是一种存在于全身器官间质和结缔组织中的成体干细胞,具有自我修复和多向分化潜能。根据其来源可将其分为骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)、肌腱干细胞(tendon-derived stem cells, TDSCs)、脂肪间充质干细胞(adipose derived stem cells, ADSCs)、滑膜间充质干细胞(synovial mesenchymal stem cells,SMSCs)。这些间充质干细胞可以自我再生并潜在地分化为不同的细胞类型,促进组织修复和再生[9]。此前BMMSCs被认为是促进腱骨愈合的最佳种子细胞,但近来研究[10]表明TDSCs的增殖分化能力强于BMMSCs,比BMMSCs表现出更多成软骨和成骨标志物,经过诱导其成脂分化、成软骨分化、成骨分化均强于BMMSCs。TDSCs成骨分化在促进腱骨愈合方面表现出较大的优势,具有广泛的临床应用前景。笔者对中药单体调控TDSCs成骨分化促进腱骨愈合的研究进行综述,以期为临床促进腱骨愈合提供新的思路。

1 肌腱干细胞成骨分化促进腱骨愈合

1.1 正常腱骨止点的解剖结构及腱骨愈合过程

腱骨止点是连接肌腱和骨骼的独特分层过渡组织,根据是否存在纤维软骨层分为直接止点和间接止点,两者结构、成分和机械性能完全不同[11-12]。直接止点存在纤维软骨层,由肌腱/韧带、未钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨和骨4种不同类型的组织组成,如RC和前后交叉韧带的腱骨界面。间接止点不存在纤维软骨层,由致密的纤维组织将韧带直接连接到骨膜,如内侧副韧带腱骨界面[9]。腱骨愈合过程包括炎症期、纤维增殖期、改造塑期3个阶段[13-16]。早在1997年,有学者[17]构建兔腱骨愈合模型,通过常规组织学和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的免疫组织化学定位发现,手术后1周可以在腱骨界面观察到炎症细胞,手术后2周可以在腱骨界面观察到疤痕组织,手术后4周可以在腱骨界面观察到疤痕组织重组形成的致密结缔组织基质,手术后第6周可以在腱骨界面观察到夏贝氏纤维。

1.2 TDSCs成骨分化促进腱骨愈合研究进展

肌腱是一种致密的结缔组织,通常呈索状或膜状,位于肌肉末端与骨骼连接处,主要由腱纤维构成,主要作用为连接骨骼和肌肉引起关节活动。由于肌腱属于低细胞密度、低血管组织,其损伤后愈合效果较差[18]。TDSCs来源于肌腱,由Bi等[19]于2007年首次在离体组织分离获得。TDSCs外形呈鹅卵石形,较普通的腱鞘细胞体积更小、细胞核更大[20]。Zhang等[20]研究表明,TDSCs体外可分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞,在体内也能够形成类似于肌腱、软骨或骨组织样结构。在腱骨愈合纤维增殖期,M1型巨噬细胞通过释放细胞因子招募间充质干细胞,促进间充质干细胞迁移至损伤部位;M2型巨噬细胞则促进间充质干细胞的存活和定向成骨分化[21]。除此之外,巨噬细胞分泌的骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)对TDSCs具有分化诱导活性,能诱导TDSCs细胞成骨分化、成脂分化及成软骨分化,进而促进腱骨愈合[22]。Liu等[23]研究发现,前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶b(protein kinase b,Akt)信号通路诱导BMP-2信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)表达,BMP-2随后激活Smad蛋白(small mothers against decapentaplegic,Smad)磷酸化,诱导成骨细胞特异性转录因子2(runt-related transcription factor-2,Runx2)和骨钙素(osteocalcin,OCN)表达促进TDSCs成骨分化。综上可知,TDSCs成骨分化能促进腱骨愈合。

2 中医学对腱骨愈合的认识

腱骨愈合属中医学“筋骨病”范畴,其病位在筋和骨。广义的筋是指筋膜、肌腱、韧带、关节软骨盘、腱鞘等软组织。筋与骨共同构成关节,从而约束骨骼,主司关节运动。《素问·痿论篇》曰:“宗筋主束骨而利机关也。”中医学认为,筋骨病的病因主要有外因和内因两类,外因主要为外力伤害和外感六淫,内因则与年老体虚、慢性劳损、肝肾亏虚等密切相关。《诸病源候论》曰:“肝主筋而藏血,肾主骨而生髓,虚劳损血耗髓,故伤筋骨也。”肝藏血,在体和筋。肝血濡养全身筋脉,肝血充足则筋强,运动灵活有力。若肝血不足,筋失濡养,则筋骨运动能力减退。肾在体和骨,生髓。肾精生髓而充骨,肾精充足则骨强。若肾精不足,则骨髓失养,骨失所养易发生骨病。因此,中医学治疗筋骨病注重“筋骨并重”,常以滋补肝肾为治则。如:沈锦涛[24]基于“筋骨并重”理论,以滋补肝肾为治则,采用中药续断治疗兔前交叉韧带重建术后模型,证明中药续断可以增加腱骨愈合界面骨小梁数量,提高骨密度,促进成纤维细胞和夏贝氏纤维增加,促进成骨,从而促进腱骨愈合;杨伟毅等[25]构建兔前交叉韧带重建术后模型,将其分为温补肾阳组、空白对照组、滋补肾阴组,采用中药干预,结果发现,滋补肾阴组腱骨愈合界面成纤维细胞、软骨细胞和胶原纤维增殖优于温补肾阳组和空白对照组,得出补肾中药可以促进腱骨愈合。以上研究从组织学角度探讨了腱骨愈合机制,但其相关信号通路及作用靶点有待进一步研究。

3 中药单体调控TDSCs促进成骨分化

现有研究表明,中药单体促进TDSCs成骨分化进而促进腱骨愈合主要通过促进成骨因子的表达,调控β-连环素(β-catenin)信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路、核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路,诱导TDSCs成骨分化,从而促进腱骨愈合。Runx2是一种成骨转录因子,是细胞成骨分化的早期标志。OCN是Runx2下游基因,由成骨细胞表达,是细胞分化为成骨细胞的标志。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)与骨的钙化密切相关。黄芩素又名黄芪苷元,是黄芩的主要有效成分之一。江华基等[26]通过建立大鼠关节外骨隧道-游离肌腱移植模型,发现黄芩素能通过促进TDSCs ALP分泌和矿化,以及Runx2、成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX)、OCN、Ⅰ型胶原蛋白α1 (collagen type I alpha 1,Col1α1)表达,诱导TDSCs成骨分化,进而促进腱骨愈合。同时,蛋白质免疫印迹结果显示,黄芩素能够促进TDSCs β-catenin蛋白的表达,使用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂分泌型蛋白Dickkopf-1可以显著抑制黄芩素的促成骨作用,由此推断黄芩素可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进TDSCs成骨分化,进而促进腱骨愈合,但其具体机制有待进一步深入研究[26]。骨碎补总黄酮是黄酮类化合物,是中药骨碎补干燥根茎的主要有效成分之一。张新涛等[27]通过大鼠关节外骨隧道-游离肌腱移植造模发现,大鼠跟腱干细胞经骨碎补总黄酮处理后,成骨因子Runx2、OCN及ALP、血管内皮生长因子表达增加,mTOR信号通路标记物磷酸化核糖体蛋白S6在TDSCs中增多,磷酸化真核翻译起始因子4E结合蛋白1减少,进而诱导TDSCs成骨和成血管,最终促进腱骨愈合。此结果表明,骨碎补总黄酮调控TDSCs成骨分化进而促进腱骨愈合与mTOR信号通路密切相关。然而,该实验存在局限性,未完全明确骨碎补总黄酮调控TDSCs mTOR信号通路促进腱骨愈合的机制,且实验所用强骨胶囊含有多种成分,可能对实验结果产生偏倚。三七总皂苷是三七的主要活性物质。史友刚等[28]通过ALP染色、茜素红染色观察及对Runx2、Osx mRNA、β-catenin蛋白表达量的研究发现:在三七总皂苷的干预下,Runx2、Osx mRNA、β-catenin蛋白表达量的表达量均增加;此外,三七总皂苷对TDSCs的促增殖和成骨分化作用与其质量分数有关,以100 mg/L质量分数为较佳。此结果表明,三七总皂苷体外诱导TDSCs向成骨细胞定向分化可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。刘晓华等[29]在前期实验研究中证实,三七总皂苷可提高重建ACL腱骨愈合处成骨能力,机制可能与TDSCs成骨分化有关;研究进一步发现,三七总皂苷能促进TDSCs成骨标志物骨ALP表达量增加,增强裸鼠皮下异位成骨能力。综上,三七总皂苷可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进TDSCs成骨分化,进而促进腱骨愈合。白黎芦醇是虎杖的干燥根茎提取物,具有强大的抗氧化、抗炎和抗分解代谢特性,有治疗骨质疏松症和类风湿性关节炎相关骨丢失的潜力[30]。王文等[31]从髌腱组织中分离TDSCs进行体外培养,结果发现,白藜芦醇能够抑制β-catenin蛋白表达,诱导成骨因子Runx2、OCN表达,促进TDSCs矿盐沉积,进而促进TDSCs的成骨分化,得出白藜芦醇可以体外诱导并促进人肌腱干细胞的成骨分化,可能通过调节β-catenin信号通路来调控。小白菊内酯是一种倍半萜内酯类化合物,具有多种药理活性,一般由木兰科或菊科植物提取。周倩等[32]研究表明,小白菊内酯在和花木兰叶片中含量最高,厚朴叶片次之。厚朴作为传统中药,在提取小白菊内酯方面有天然优势。肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)是炎症反应的主要调节因子。李知玻等[33]研究表明,TNF-α能抑制成骨细胞生长。许华亮等[34]研究发现,小白菊内酯可以抑制TDSCs被TNF-α刺激后NF-κB信号通路关键蛋白p65的表达,进而促进Runx2和下游基因OCN的表达,表明小白菊内酯可能通过抑制NF-κB信号途径和炎症反应促进TDSCs成骨分化。由此可知,小白菊内酯可能是促进TDSCs成骨分化进而促进腱骨愈合的潜在有效中药单体。

4 小 结

综上所述,TDSCs成骨分化对促进腱骨愈合有重要意义。我国中药种类繁多,质量优良,具有简、便、廉、效等特点。近年来随着研究的不断深入,越来越多的证据表明中药单体在促进TDSCs成骨分化进而促进腱骨愈合方面具有巨大的应用前景,其主要通过调节相关信号通路及提高成骨因子的表达促进TDSCs成骨分化达到腱骨愈合的目的。但由于TDSCs成骨分化机制复杂,中药单体调控TDSCs成骨分化的确切机制尚未完全清楚,有待临床进一步深入研究。除此以外,中药单体调控TDSCs成骨分化促进腱骨愈合的研究较少,且实验多为体外细胞培养,动物造模较少,缺乏大量临床观察研究,有待进一步深入研究。因此,今后当利用现代生物学技术,从多信号通路、多基因、多靶点等方面进一步深入研究中药单体调控TDSCs成骨分化促进腱骨愈合的机制,挖掘出更多有效中药单体,以促进临床腱骨愈合。