基于代谢组学探究电针干预去势大鼠骨质疏松的起效机制研究

屈媛媛,杨添淞,冯楚文,孙忠人,林楚华,王庆勇,马 帅,秦鸿宇,鲍圣涌△

1.深圳市人民医院 暨南大学第二临床医学院 南方科技大学第一附属医院,广东 深圳 518020;2.黑龙江中医药大学第二临床医学院,黑龙江 哈尔滨 150001;3.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040;4.黑龙江省针灸临床(脑病)神经生物学重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150040

绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)是以全身骨量减少、骨微观结构退化为特征的代谢性疾病。绝大多数PMOP在女性绝经后5～10年内发生[1],随着老龄化加剧,加重了家庭和社会的经济负担[2]和人力照料的压力。PMOP的西医治疗以药物治疗为主,大多数药物存在服药周期长、不良反应多与使用不便等缺点[3]。研究证实针灸防治PMOP有效[4-5],在改善骨密度(Bone mineral density,BMD)、激素水平与骨代谢等方面疗效显著。前期研究证实电针关元、后三里可以改变去势骨质疏松大鼠的骨矿物质含量、BMD、E2水平及炎症因子等[6-7]。

代谢组学旨在定量研究生命体对外界刺激、病理生理变化以及本身基因突变而产生的体内代谢物水平的多元动态反应[8],其中非靶向代谢组学能够最大程度体现生物样品体系中总的代谢物信息,尽可能定性和相对定量[9],适宜探究针灸多靶点的起效机制;靶向代谢组学则绝对定量代谢物,特异性强,灵敏度高,定量准确[10]。因此,本研究应用去势雌性大鼠建立骨质疏松模型,利用非靶向代谢组学探究电针对去势大鼠粪便代谢物的影响,并结合靶向代谢组学,试图解析E2和缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)在电针抗骨质疏松中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雌性SPF级大鼠80只,6月龄,体质量(320±30)g,购自青岛市实验动物和动物实验中心[许可证编号:CXK(鲁)2014 0001]。于SPF级实验室适应性饲养7 d,在此期间大鼠自由饮水进食,环境温度22～24 ℃,相对湿度40%～60%,昼夜节律12 h光/12 h暗。每日定期更换垫料,清洗大鼠饮水器并补充饲料及饮用水。本实验经深圳市人民医院医学伦理委员会批准(编号:LL-KY-2019170)。实验过程符合动物伦理相关规定。

1.1.2 主要仪器和试剂 HANS-200A电针仪(南京济生);InAlyzer双能X线骨密度仪(韩国MEDIKORS);QTRAP 5500质谱仪(上海AB SCIEX);Triple TOF 5600质谱仪(上海AB SCIEX);Nexera X2 LC-30AD超高压液相色谱仪(日本Shimadzu);1290 Infinity LC超高压液相色谱仪(美国Agilent);色谱柱(美国Waters);乙腈(德国Merck);甲醇(德国Merck);甲酸(美国Fluka);乙酸铵(美国Sigma);氨水(德国Merck);代谢标准品(Sigma-Aldrich)。

1.2 分组及干预方法

将80只6月龄,体质量(320±30)g的雌性大鼠随机分为两组,假手术组(Con)20只和造模组60只。3%戊巴比妥钠(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉后,Con组大鼠切除卵巢周围部分脂肪组织(大小同卵巢)后缝合,造模组切除双侧卵巢。保温待麻醉苏醒。术后连续3 d肌注青霉素生理盐水(4万单位/mL)抗炎,1.5 mL/d。自由摄水和进食标准饲料,其中钙和磷含量分别为0.6%和0.4%,饲养12周[11],期间不予任何干预。

将造模成功大鼠随机分为模型组(Mod)20只与电针A组(MA)20只、电针B组(MB)20只。MA和MB组大鼠接受电针治疗,参考《实验动物常用穴位名称与定位第2部分:大鼠》[12]取穴关元、后三里,大鼠固定,穴区剪毛备皮,75%乙醇常规消毒后,使用一次性无菌针灸针直刺进针,关元进针3 mm,双侧后三里进针3 mm。连接电针,正极接后三里(两侧隔日交替连接电针),负极接关元(疏密波,2 Hz/15 Hz,1 mA)[6-7]。电针治疗1次/d,15 min/次,留针10 min,连续治疗6 d后休息1 d。MA和MB组大鼠分别接受连续4周、8周治疗后取材。

1.3 标本收集

每组随机选取10只大鼠,将其置于代谢笼中收集粪便,放入-80 ℃低温冰箱保存,待进行非靶向代谢组学检测。随后各组所有大鼠接受3%戊巴比妥钠(1 mL/100 g)麻醉,腹主动脉取血离心后将血浆置于EP管中称重,放入超低温冰箱备用,待进行靶向代谢组学检测。颈椎脱臼法处死大鼠后,取右侧胫骨、第5腰椎体,PBS生理盐水浸透的纱布包裹骨骼,装入密闭EP管中并编号,随即进行BMD检测。

1.4 检测指标及方法

1.4.2 靶向代谢组学定量E2、HIF-1α 代谢物提取方法为每例样本加1 mL预冷甲醇/乙腈/水(2∶2∶1,v/v/v),混匀,冰浴中超声60 min,-20 ℃孵育1 h沉淀蛋白,14 000 g 4 ℃离心20 min,取上清,500 μL SDT裂解液复溶沉淀蛋白质,BCA定量,推算不同样品中代谢物的相对含量,然后每例样品取等量代谢物加入等量内标,真空干燥。质谱时加入100 μL乙腈-水溶液(1∶1,v/v)复溶,14 000 g 4 ℃离心15 min,取上清进样分析。LC MS/MS分析:样品复溶于200 μL 50%甲醇水溶液,置于4 ℃自动进样器中,采用Nexera X2 LC-30AD高效液相色谱进行分离。进样量5 μL,柱温40 ℃,流速0.3 mL/min。流动相A:5%乙腈水溶液+20 mM乙酸铵,pH 9.45;B:100%乙腈。液相梯度:0～1 min,95% B液;1～12 min,B液95%→55%;12～13 min,B液55%→40%;13～15 min,40% B液;15～15.1 min,B液40%→95%;15.1～18 min,95% B液。样本队列中插入QC样品监测和评价系统稳定性及数据可靠性。使用QTRAP5500质谱仪分析。ESI源参数:正离子模式为Source temperature 550 ℃,ion source gas1(GAS1):40,Ion source gas2(GAS2):50,Curtain gas(CUR):35,Ion spray voltage floating (ISVF)5 500 V。负离子模式为Ion spray voltage floating (ISVF)-4 500 V,余同正离子模式。采用MRM模式检测待测离子对。数据处理:采用MultiQuant软件提取色谱峰面积及保留时间。使用代谢物标准品校正保留时间,进行代谢物鉴定。

1.4.3 粪便非靶向代谢组学检测 代谢物提取方法为取样品液氮研磨,取100 mg加200 μL预冷水和800 μL预冷的甲醇/乙腈(1∶1,v/v),混匀,冰浴中超声60 min,-20 ℃孵育1 h沉淀蛋白,16 000 g 4 ℃离心20 min,取上清,置于高速真空浓缩离心机挥干。质谱时加入100 μL乙腈-水溶液(1∶1,v/v)复溶,14 000 g 4 ℃离心15 min,取上清进样分析。LC-MS/MS分析:样品置于4 ℃自动进样器中,采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统分离。进样量5 μL,柱温25 ℃,流速0.3 mL/min。流动相A:水+25 mM乙酸铵+25 mM氨水;B:乙腈。液相梯度:0～0.5 min,95% B液;0.5～7 min,B液95%→65%;7～9 min,B液65%→40%;9～10 min,40% B液;10～11.1 min,B液40%→95%;11.1～16 min,95% B液。样本队列中插入QC样品。使用Triple-TOF 5600质谱仪分析。ESI源参数:Ion Source Gas1(Gas1):60psi,Ion Source Gas2(Gas2):60psi,Curtain gas(CUR):30psi,source temperature:600 ℃,IonSapary Voltage Floating(ISVF)±5 500 V(正负两种模式); TOF MS scan m/z range:60～1 200 Da, production scan m/z range:25～1 200 Da,TOF MS scan accumulation time 0.15 s/spectra, product ion scan accumulation time 0.03 s/spectra;二级质谱采用information dependent acquisition (IDA)获得,采用high sensitivity 模式,Declustering potential(DP):±60 V(正负两种模式),Collision Energy:30 eV,IDA设置为Exclude isotopes within 4 Da,Candidate ions to monitor per cycle:6。数据预处理:原始数据格式转换后采用MSDIAL软件中的程序XCMS进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配(<25 ppm)和二级谱图匹配的方式,检索HMDB、MassBank等公共数据库及自建代谢物标准品库。提取数据,删除组内缺失值>50%的离子峰,整合正负离子峰并应用软件SIMCA-P 14.1(Umetrics,Umea,Sweden)进行模式识别,数据经UV(Unit variance)scaling预处理后,进行多维统计分析,包括无监督主成分分析(PCA),有监督偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。

2 结果

2.1 各组BMD检测结果

与假手术组比较,模型组大鼠胫骨和椎骨的BMD均下降,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,电针A组和B组的BMD升高,差异具有统计学意义(P<0.01);且B组优于A组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 胫骨和椎骨的BMD检测情况

2.2 各组E2、HIF-1α检测结果

与假手术组比较,模型组大鼠血清E2水平下降,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,电针A组和B组E2水平升高(P<0.01);且B组优于A组,差异具有统计学意义(P<0.01)。与假手术组比较,模型组大鼠血清HIF-1α水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,电针A组和B组HIF-1α水平下降(P<0.05或P<0.01);且B组优于A组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组E2、HIF-1α检测情况

2.3 粪便代谢组学结果分析

2.3.1 PCA结果 PCA是一种非监督的数据分析方法,采用该法观察所有样本之间的总体分布趋势。发现各比较组之间分离趋势明显,证明各组间代谢物存在明显差异。见图1。

注:A为Con vs Mod结果;B为Mod vs MA结果;C为Mod vs MB结果;D为MA vs MB结果。图1 PCA得分图

2.3.2 OPLS-DA结果 OPLS-DA是一种有监督的判别分析统计方法,该方法运用偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型,来实现对样品类别的预测。见图2,可见OPLS-DA模型能明显区分两组样本;R2Y、Q2≥0.5,模型稳定可靠。图3显示了基于该组OPLS-DA模型的置换检验图,横坐标代表随机分组Y与原始分组Y的相关性,纵坐标代表R2和Q2的得分,其中Q2截距小于0.05表明本实验数据建立的OPLS-DA模型不存在过拟合。OPLS-DA模型的评价参数见表3。

注:A为Con vs Mod结果;B为Mod vs MA结果;C为Mod vs MB结果;D为MA vs MB结果。图2 OPLS-DA得分图

表3 OPLS-DA模型的评价参数

2.3.3 粪便显著性差异代谢物 根据OPLS-DA模型得到的变量权重值(Variable importance for the projection,VIP)来衡量各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力,挖掘具有生物学意义的差异代谢物。本试验中以VIP>1且P.value(One-Way Anova value)<0.05的代谢物作为显著性差异代谢物。经过筛选,假手术组vs模型组(Con vs Mod)共发现209个显著差异代谢物,模型组vs电针A组(Mod vs MA)共发现240个显著差异代谢物,模型组vs电针B组(Mod vs MB)共发现243个显著差异代谢物。经过对比筛选各组显著性差异代谢物,共68个代谢物在造模后发生下降或上升,且在电针治疗后回调;治疗组排名前10的差异代谢物中,MA组6个发生回调,MB组全部回调。各比较组显著差异代谢物(前10)见表4。

表4 各比较组差异代谢物(前10)

2.3.4 KEGG通路富集分析 气泡图,图中每个图形表示一个Kegg pathway,纵坐标文字表示pathway名称,横坐标表示富集率;图形越大表示差异代谢物的数目越多;颜色表示富集的显著性即Pvalue,红色越深表示该通路越显著富集,右侧颜色梯度表示Pvalue大小。

对比各组KEGG代谢通路富集分析发现,假手术组和模型组差异代谢物的显著富集通路主要为Vitamin digestion and absorption(维生素的消化和吸收),其他有Vitamin B6metabolism(维生素B6代谢)、Thiamine metabolism(硫胺代谢)、Taste transduction(味觉传导)和Protein digestion and absorption(蛋白质消化吸收)通路。电针干预后发生回调的显著性差异代谢物主要富集在Bile secretion(胆汁分泌)通路上,其他代谢通路有Taste transduction(味觉传导)、Histidine metabolism(组氨酸代谢)和Prolactin signaling pathway(催乳素信号通路)。其中造模后、治疗后的代谢物均在Taste transduction通路上显著富集。见图4。

注:A为Con vs Mod结果;B为Mod vs MA结果;C为Mod vs MB结果;D为MA vs MB结果。图4 显著差异代谢物KEGG代谢通路富集分析气泡图(Top10)

3 讨论

电针是电刺激疗法和针灸疗法结合后的产物,与毫针刺法的使用范围基本相同,增加了单次刺激量[13],同时前期研究证实电针治疗PMOP有效。本研究旨在探究电针干预PMOP的潜在代谢机制。BMD结果证实造模成功及治疗有效,随着干预时间延长,BMD变化呈现出干预时效的累加性。造模成功后大鼠体内的雌激素水平必然存在下降,本研究从PMOP的致病原因出发,探究电针的治疗机制,选择E2作为主要理化检测指标,解析激素水平与氧化应激、肠道代谢之间的关系。骨内稳态是通过成骨细胞(Osteoblast,OB)介导的骨形成和破骨细胞(Osteoclast,OC)驱动的骨吸收之间的平衡来维持的。缺氧通过HIF-1α对OC形成和骨吸收的直接和间接作用部分调节这种关系[14],HIF-1α在骨形成、重塑和体内稳态中起着关键作用[15]。研究发现HIF-1α可增加OC的数量及破骨活性[16],并通过促进骨折过程中的OC生成影响成骨作用[17]。同时,HIF-1α一方面通过调节血管生成-成骨细胞偶联促进骨再生;另一方面通过诱导OB代谢重编程,促进细胞无氧糖酵解,保证OB在缺氧条件下的能量供应,促进骨再生和修复[18]。HIF-1α与E2调控关系的实验证实,在OC中HIF-1α的活性被E2抑制,而E2缺乏可以激活骨的再吸收、促进骨丢失[19]。有研究在去势雌性骨质疏松大鼠中发现造模后E2水平下降,伴随HIF-1α增加[20]。本研究呈现出与以上研究一致的结果,电针后三里和关元可能通过升高E2水平进而抑制HIF-1α,达到抗骨质疏松的作用。

肠道微生物产生代谢物影响软骨细胞和骨细胞中的氧化还原反应,以调节关节和骨组织的稳态,补充肠道微生物群衍生的代谢物可能会减缓骨关节炎和骨质疏松症的发展[21]。进一步大量查阅文献发现,发生回调的68种代谢物中与骨代谢相关的代谢物有14种,其中包含组间显著差异代谢物Gabapentin(加巴喷丁)、Arteannuin B(青蒿素B);与性激素水平相关的代谢物有10种,包含组间显著差异代谢物Gabapentin、L-Tyrosine(L-酪氨酸)。

研究者利用真/假睾丸切除大鼠实验证实,口服富含Gabapentin的日粮不影响骨密度或机械性骨强度,但是核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of nuclear factor-κ B ligand,RANKL)水平的变化表明,Gabapentin对OC活性的影响可能取决于体内激素状态[22]。Gabapentin诱导松质骨稀疏与骨形成减少和骨吸收增强有关,并可能影响长期暴露后的骨强度和骨密度[23]。在Gabapentin呈阳性的样本中发现,48～55岁女性的游离E2浓度降低[24],证实Gabapentin会导致女性游离E2下降,二者之间的变化趋势关系与本研究呈现的结果一致。

Arteannuin B与青蒿素共存于青蒿中,可抗炎抗疟。研究通过检查三维图像和Micro-CT分析的骨形态计量学参数以及骨转换标记物和促炎因子的血清水平证实,给予去卵巢小鼠口服Arteannuin B可防止骨质流失,有效抑制RANKL诱导的OC生成和OC介导的再吸收,显著降低在RANKL诱导的OC分化中起关键作用的c-Fos和NFATc1转录因子的表达[25]。去卵巢后,大鼠肝脏和尿液中的苯丙氨酸/L-Tyrosine比值显著降低,通过E2替代恢复,而肾脏中的比值未受影响[26]。

文献表明,与氧化炎症相关的回调代谢物有6种。其中,N,N-Dimethylaniline以浓度依赖性方式抑制缺氧诱导的HIF-1α累积,但不影响HIF-1mRNA表达[27]。利用氧化应激诱导体外大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的实验首次确定了Artemisinin的保护作用[28]。Bufalin可通过抑制mTOR激活和HIF-1α诱导,抑制卵巢癌细胞生长和迁移[29]。Sophoridine抗肿瘤的主要机制之一是诱导细胞产生活性氧进一步抑制HIF-1α泛素化降解,从而稳定HIF-1[30]。Geissoschizine methyl ether通过阻断谷氨酸诱导的脂质过氧化和脂质毒性,对氧化应激起保护作用,可能为氧化损伤神经元的预防和治疗提供有效途径[31]。Tenuifoliside A能抑制NO、诱导型一氧化氮合酶、前列腺素E2和环氧合酶-2活性,抑制TNF-α和IL-1β等促炎细胞因子的产生[32]。其他代谢物的作用还涉及调节信号传导[33-35]、促进神经修复[36]、抑制细胞异常增殖[37-38]、心血管获益[39]和镇痛[40]等。

对显著性差异代谢物进行代谢通路富集分析发现,假手术组和模型组差异代谢物的显著富集通路为Vitamin digestion and absorption,电针干预后发生回调的显著性差异代谢物主要富集在Bile secretion,Taste transduction为造模后、治疗后代谢物均显著富集的通路。众所周知,维生素必须通过肠道吸收从外源获得。而胆汁作为一种重要的分泌物,对小肠内脂肪和脂溶性维生素的消化和吸收至关重要。Taste transduction则通过I型、Ⅱ型和Ⅲ型细胞传导苦、甜、酸、咸和鲜味5种味觉刺激。

综上,电针治疗可明显改善去势骨质疏松大鼠的BMD、E2水平,降低HIF-1α含量,同时显著改善大鼠粪便代谢物。本研究中,电针干预后显著改善与本研究相关的差异代谢物主要为Gabapentin、Arteannuin B和L-Tyrosine;造模所致差异代谢物的显著富集通路为Vitamin digestion and absorption,电针干预后回调的显著性差异代谢物主要富集在Bile secretion。由此推测,电针关元、后三里穴可能通过提高E2水平抑制HIF-1α活性从而减轻体内氧化炎症反应进而改善骨质,粪便代谢物主动或被动参与其中,具体机制有待试验下一步论证。