酶解糖化滇黄精多糖的结构表征及其免疫活性

黄俊源，袁晚晴，苏艺，杨淑婷，黎攀，陈建萍，杜冰＊

（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）（2.香港大学李嘉诚医学院中医药学院，中国香港 999077）

滇黄精（Polygonatum kingianumColl,et Hemsl,P.kingianum）是百合科黄精属植物，主要分布在我国云南[1]，因其营养价值高，且具有传统的药食同源用途而备受青睐[2]。多糖是黄精中的主要活性成分之一，其免疫调节、防止氧化损伤、抗衰老、抗骨质疏松和抗炎等功能已得到广泛的研究[3]。

随着现代社会发展，人们对健康愈发关注，消费者和行业都在寻找自然、安全的免疫调节材料[4]。多糖被认为在人体内和体外具有增强细胞介导的免疫反应作用，并逐渐成为生物反应调节剂的一种重要角色[5]。研究表明，黄精多糖对RAW264.7 细胞具有促增殖作用并对细胞分泌一氧化氮（NO）有明显的促进作用[6]，具有成为免疫调节剂的潜力[7]。然而，黄精多糖的结构特征与免疫活性密切相关，包括单糖组成比例、官能团类型和糖苷键连接方式等，而不同的加工、炮制和提取方式则会对多糖的结构特征产生显著的影响[8,9]。酶解糖化是食品加工的一项常用的技术，通过酶的催化作用将复杂的碳水化合物分解成简单的单糖，例如葡萄糖和果糖等[10]，还能给微生物发酵提供大量所需的糖类物质，促进发酵过程的进行。课题组前期发明了一种新的黄精酶解糖化工艺[11]，但该新工艺下的黄精多糖结构仍鲜有报道。本研究旨在分析酶解糖化黄精多糖（Enzymatic SaccharifyP.kingianumPolysaccharide，SPKP）结构特征，并通过对免疫活性的研究对其构效关系进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜滇黄精购于云南省普洱市，经香港大学李嘉诚医学院中医药学院首席讲师陈建萍博士鉴定为4 年生百合花滇黄精的干燥根茎，多糖含量占28.2%，符合《中华人民共和国药典》2020 版的要求。α-淀粉酶（耐高温POWERLIQ 型）A30278G190，杰能科（中国）生物工程有限公司；高效糖化专用酶SGA 2.0 S 型，山东隆科特酶制剂有限公司；单糖标准品，Sigma-Aldrich；RAW264.7 细胞从中山大学药学院获取；DMEM 培养基、胎牛血清、青霉素链霉素混合液、磷酸盐缓冲溶液（PBS），Gibco公司；细胞增殖-毒性检测试剂盒CCK8，SEVEN公司；一氧化氮（NO）检测试剂盒，上海碧云天生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

光栅型酶标仪VersaMax，美国Melecular Devices公司；紫外可见分光光度计Evolution 300，赛默飞世尔科技有限公司；冷冻干燥机ALPHA 2-4 LDplus，德国Christ 公司；傅立叶变换红外光谱仪Vertex 70，德国布鲁克公司；扫描式电子显微镜EVO MA 15，德国ZEISS 公司；离子色谱仪ICS5000，ThermoFisher 公司；气相质谱联用仪6890-5973，Agilent Technologies 有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解糖化黄精多糖制备

将鲜黄精块茎去除须根后清洗去皮，称取200 g按料液比1:2 加水混合，加入1 mL 质量分数为37.5%的CaCl2溶液，添加50 μLα-淀粉酶后于85 ℃下水浴加热1 h。然后用柠檬酸调节pH 值至5.0，待酶解液降至60 ℃左右添加50 μL 糖化酶，于60 ℃水浴加热1 h 后立即在100 ℃水浴加热5 min（灭酶）。抽滤后取滤液，通过旋转蒸发仪蒸发浓缩，即得酶解糖化液。加入体积为上述浓缩液4 倍的无水乙醇，摇匀，4 ℃冷藏，静置过夜，取出，以4 000 r/min 速度离心20 min，弃去上清液。得到的沉淀加蒸馏水溶解。将所得溶液置于旋转蒸发仪中进行低温减压蒸馏，除去乙醇，得粗多糖溶液[12]。

采用Sevage 试剂脱蛋白（Sevage 试剂V三氯甲烷:V正丁醇=4:1），按照多糖溶液：Sevage 试剂的体积比为4:1 加入50 mL 离心管进行混合，在振荡器中机械振荡20 min（300 次/min），随后将混合液以4 000 r/min 速度离心5 min，静置，弃去下层有机层和中间的蛋白层，重复操作6 次以上直至蛋白除尽。最后合并所得的上清液，55 ℃低温减压蒸馏除去氯仿和正丁醇[13,14]。将规格为1 000 u 的透析袋煮开3～4 min，随后将透析袋一端扎好后，倒入适量浓缩后的多糖溶液，在4 ℃下用三级水逆流透析，每隔6 h 换一次三级水，直到所测透析液的电导率接近三级水的电导率（≤1.5 μs/cm）[15]，得到多糖样品。

1.3.2 标准曲线绘制及多糖、还原糖含量测定

以葡萄糖为基准，采用苯酚-硫酸法，在波长490 nm 处测吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线[14]并测定多糖含量。

以葡萄糖为基准，采用DNS 法，在波长540 nm处测吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线[16]并测定还原糖含量。

1.3.3 分子量的测定

参考文献[17]对SPKP 的分子量分布采用高效凝胶渗透色谱法（High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）进行测定。

1.3.4 傅里叶变换红外（Fourier Transform Infrared，FT-IR）光谱

参考文献[18]的方法，利用傅里叶变换红外仪测定两组黄精多糖的红外光谱。

1.3.5 单糖组成测定

参考文献[19]的方法，进行单糖组成测定。

1.3.6 一级分支结构测定

采用碘-碘化钾实验测定一级分支结构[20]。

1.3.7 甲基化分析

参考文献[19]的方法，对多糖进行甲基化分析。

1.3.8 三股螺旋结构测定

参考文献[20]的方法，采用刚果红实验进行三股螺旋结构测定。

1.3.9 扫描电子显微镜测定

将多糖样品置于样品台上，并使用扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）进行测定。将导电膜粘附在样品架上，然后将少量多糖样品均匀地洒在表面上并通过二次电子信号成像进行观察[21]。

1.3.10 免疫活性测定

1.3.10.1 RAW264.7 细胞培养

小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7 加入DMEM完全培养基（含10%胎牛血清和质量分数为1%青霉素-链霉素双抗）中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，当细胞铺满培养瓶底部80%时进行传代[22]，将培养至对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3.10.2 细胞存活率的测定

RAW264.7 细胞在96 孔板中培养，接种密度为每孔1×104个。24 h 贴壁后分别加入25、50、100和200 μg/mL 的SPKP，每组样品设置6 个平行。在37 ℃下孵育24 h 后每孔加入10 μL CCK8 试剂，在37 ℃培养箱内孵育1 h 后，用酶标仪检测其在450 nm 波长处的吸光度。各处理组与空白对照组吸光度的比值×100%即为细胞存活率。

1.3.10.3 RAW264.7 细胞吞噬能力和NO 浓度测定

参考文献[23]的方法，测定RAW264.7 的吞噬能力以及NO 含量。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2016 软件处理数据，每组实验平行测定6 次，结果以x-±s 表示；采用SPSS 26.0 软件进行数据统计学分析，采用方差分析、Duncan 多重范围检验差异显著性分析；使用Origin 2023 软件进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 多糖基本成分及分子量分析

多糖的基本成分和分子量结果见表1，通过苯酚硫酸法绘制的葡萄糖标准曲线为Y=0.005 4X+0.001 5，R²为0.999 5 有较好的拟程度。测出SPKP 多糖量为94.05%。通过DNS 法绘制的标注曲线为Y=0.431 4X-0.011 3，R²为0.998 6。为测得还原糖含量为4.1%。结合前期鉴定结果与Liang 等[24]和Wang 等[25]的研究可知，黄精的多糖含量丰富，容易提取且在醇沉、脱蛋白和透析之后就有极高含糖量，因此本论文将该SPKP 样品直接用于后续结构分析和活性实验。

表1 SPKP基本成分及分子量Table 1 Basic composition and molecular weight of SPKP

多糖的分子量与其生物活性密切相关[26]，SPKP的HPGPC 色谱图见图1。SPKP 的分子量分布范围较窄，且分子量普遍不高。分子量分布结果显示，SPKP 含有一类组分，数均分子量Mn为3 156 u，重均分子量Mw为3 820 u，多分散性为1.21。

图1 SPKP的分子量图谱Fig.1 Molecular weight profile of polysaccharides of saccharify P.kingianum polysaccharide

2.2 傅立叶变换红外分析

如图2 所示，FT-IR 光谱显示出4 000～400 cm-1范围内多糖的典型吸收峰。SPKP 在3 369 cm-1处是-OH的特征吸收峰，2 937 cm-1处的特征吸收峰为C-H 键，在1 016～1 147 cm-1范围内则为吡喃糖单位特征峰，与万晓莹[6]的研究结果相近。931 cm-1处是吡喃糖形式的甘露糖和葡萄糖中β主导构型的代表[27]，基于此可以推测SPKP 中含有较多的甘露糖或葡萄糖。

图2 SPKP多糖的红外谱图Fig.2 FT-IR spectra of SPKP

2.3 单糖组成

如图3 所示为标准样品离子色谱图，横坐标为检测的保留时间（Time，min）。根据单糖标准品的保留时间和峰面积，可知SPKP 由5 种单糖组成的杂多糖，单糖组成及摩尔比为：阿拉伯糖 : 半乳糖 : 葡萄糖 : 甘露糖 : 果糖=0.032:0.117:0.419:0.048:0.383，含有较多的葡萄糖，这与2.2 中推测的结果一致。Li等[28]研究的滇黄精多糖的单糖组成为甘露糖 : 葡萄糖 : 半乳糖 : 葡萄糖醛酸=1:7.22:0.16:0.05:0.02（摩尔比），与本研究结果有一定区别，且不含果糖，这可能是因为在本工艺下的黄精多糖在α-淀粉酶和糖化酶的作用下进一步导致糖苷键断裂进一步分解转换成了葡萄糖或果糖，从而导致SPKP 的单糖组成以葡萄糖和果糖占比为主。

图3 标准单糖混合物和SPKP多糖的离子色谱图Fig.3 Ion chromatograms of standard monosaccharide mixtures and SPKP

2.4 一级分支结构分析

多糖分子中含有许多羟基（-OH）官能团，其中的部分羟基能够与碘化钾反应，形成一种蓝黑色的多糖-碘络合物，通过测量多糖-碘络合物的吸光度，从而可以判断多糖的一级结构[29]。本实验中对SPKP和碘-碘化钾试剂混合后在300～700 nm 范围内的扫描光谱进行了测量，结果如图4 所示。由图可知，SPKP与碘-碘化钾试剂的反应液在350 nm 波长附近处均有强吸收峰；在550 nm 处无吸收峰，这表明SPKP 可能存在复杂的链状结构，其侧链较长、支链较多，与王飞凤[30]研究的未酶解糖化的黄精多糖结果相近。

2.5 甲基化结果分析

将多糖进行甲基化和衍生化后得到糖精乙酸酯衍生物再通过GC-MS 从而确定其糖苷键的连接方式[31,32]。图5 为SPKP 的甲基化GC-MS 图，从单糖组成结果可知SPKP 含有果糖，由于果糖为酮糖，在还原过程中会异构化成甘露糖和葡萄糖，得到的甲基糖苷异构化成呋喃环的甘露糖苷和葡萄糖苷。因此，将Manf-(2 →、Glcf-(2 →、→1)-Manf-(2 →和→1)-Glcf-(2 →的糖苷键整合得到Fruf-(2 →和→1)-Fruf-(2 →，结果如表2 所示。结合表2和2.3 单糖组成的结果可知，SPKP 中的单糖以葡萄糖为主，所以其主要的糖苷键连接方式为为→4)-Glcp-(1 →（占47.1%）。根据DB（分支度）=（末端残基+分支残基）/（末端残基+分支残基+线性残基）计算SPKP 的分支度（DB）值分别为34.1%，结果表明SPKP 存在复杂的分支结构，与2.4中推测的结果一致。

图5 SPKP甲基化结果Fig.5 Methylation results of SPKP

表2 SPKP甲基化结果Table 2 Methylation results of polysaccharides from SPKP

2.6 三股螺旋结构分析

刚果红是一种生物染色剂，它能够与多糖中的单股螺旋结构结合成复合物，使反应溶液的最大吸收波长随着单股螺旋结构浓度的升高而变大。在一定的碱性体系中，多糖中的三股螺旋结构发生解聚，使单股螺旋结构的浓度增大，反应溶液的最大吸收波长也会发生变化[33]。对于SPKP，图6 显示它在NaOH浓度分别为0.2～0.3 mol/L 范围时，表现出紫外最大吸收光的增加，且发生了明显红移，表明样品与刚果红发生了络合反应。但随着浓度的继续增加，在强碱条件下多糖螺旋结构可能解体成无规则的单股线团，不能与刚果红反应生成络合物，多糖最大吸光值相应减少，由此推测SPKP 存在三螺旋结构。

图6 刚果红实验结果Fig.6 Results of the Congo red experiment

2.7 SEM 分析

SEM 技术通常用于观察多糖的表面形态。如图7 所示，SPKP 的表面较光滑，有鼓起部分，凹凸不平，与Liu 等[34]的未酶解糖化的黄精多糖结构相比，无明显结构特征，方晨璐等[35]发现酶的种类、单一与复合作用都会影响到分子表面形态。SPKP可能其表面结构可能受到了酶解条件的影响。综上，不同的炮制方法是影响其表面形态的关键因素。

图7 黄精多糖样品的扫描电镜图Fig.7 SEM result of the SPKP

2.8 SPKP 对RAW264.7 免疫细胞活性影响

如图8a 所示，与空白对照组相比SPKP 能显著促进细胞的增长（P＜0.05），SPKP 在100 μg/mL时细胞活力最高，达到153.77%，在200 μg/mL 处均有一定程度下降但仍保持较高的细胞存活率，说明在一个较广的给药范围内，SPKP 仍未见对细胞存活造成明显影响，说明本文研究的两种多糖对RAW264.7 细胞有较优的安全性。

图8 不同浓度的多糖对细胞增殖（a）、吞噬能力（b）、和NO（c）的影响Fig.8 Effect of the polysaccharide on the viability (a),phagocytosis (b),production of NO (c) of RAW264.7 cells with different concentrations.

以吞噬形式存在的细胞外物质是巨噬细胞效应或活动的关键指标；一氧化氮（NO）作为一种重要的信号转导介质，在免疫系统中发挥着重要作用，当巨噬细胞被激活后，会产生NO，并与超氧阴离子自由基反应形成过氧亚硝基阴离子，以帮助机体对抗外来抗原，实现免疫调节作用[23]。由图8b、c可知，当质量浓度为50 μg/mL 时，SPKP 的吞噬率和NO 水平达到最优效果，分别为239.24%和22.95 μmol/L，但随着质量浓度的提高，其效果均有所降低。然而，与正常组相比，SPKP 在各浓度下均能刺激细胞的吞噬活性（P＜0.05）和促进NO 水平（P＜0.05）。综上所述，本研究中SPKP 具有效果较好的吞噬能力和NO 分泌能力。

2.9 SPKP 对免疫活性的构效关系分析

多糖的免疫活性与其分子量、单糖组成、化学官能团等结构特征密切相关。通常，多糖的分子量是影响其在水溶液中构型和形态的主要因素之一，低分子量多糖可以穿越细胞膜进入细胞内从而直接刺激启动免疫应答[36]，因此，低分子量SPKP 可能通过直接刺激途径激活RAW264.7 细胞，促进其增殖并分泌NO。有关研究[37,38]发现，含有半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖等的多糖能更好的被巨噬细胞受体识别，发挥免疫活性，而Fu 等[39]也发现以（1 → 4）糖苷键连接甘露糖（Manp）和葡萄糖（Glcp）为主的多糖，具有良好的免疫调节作用。单糖组成和甲基化的结果表明SPKP 中葡萄糖和甘露糖的占比较高且主要糖苷键连接类型为→4)-Glcp-(1 →，这可能是SPKP 具有较好免疫功效的原因之一；同时三股螺旋构象因其丰富的游离羟基和疏水空腔也被认为拥有与巨噬细胞受体相互作用的可能。

3 结论

本实验研究了酶解糖化后的滇黄精多糖的结构与免疫活性，提取到了一种具有复杂分支和三股螺旋结构的葡聚糖SPKP，其单糖组成主要为甘露糖和葡萄糖，→4)-Glcp-(1 →糖苷键为主要的连接方式。RAW264.7 细胞实验结果可以推测出SPKP 有较好明显的免疫功效。这些结果丰富了新炮制方法下黄精多糖结构研究的知识，为黄精新炮制工艺的研究提供了参考。然而，对于新炮制方法下的黄精多糖，我们仍需进一步探索其结构与活性关系以更好地了解其免疫调节机制。