灰树花多肽-锌螯合物对孕期缺锌鼠后代的改善作用

张凤丽，李静茹，彭培植，黄文琪，赵立娜

（福建农林大学国家菌草工程技术研究中心，福建农林大学生命科学学院，福建福州 350002）

灰树花（Grifola frondosa）是一种具有食用和药用价值的真菌[1,2]，主要含碳水化合物、维生素、蛋白质和有多种生物活性的甾醇等[3]。灰树花因其具有独特的药用及营养价值而受到广泛关注[4]，在全球菌类产量中位居第二[5]。灰树花蛋白质质量分数为25.20%，人体所需氨基酸质量分数为18.68%，其中必需氨基酸占总氨基酸质量分数的45.50%。灰树花蛋白质因具有营养价值和平衡机体所需的氨基酸而备受关注[6]。灰树花还有多种生理活性，如抗肿瘤[7,8]、免疫调节，抑菌、抗病毒、抗糖尿病、降血糖[9]等。作为灰树花的活性成分之一，灰树花多肽也具有抗氧化、抗菌、免疫调节、降血脂和降血糖等活性[10]。

锌是人体内不可缺少的微量元素，大多分布在骨骼、肌肉、血浆和头发[11]，对人体健康及生长发育有重要的生物学作用[12]。缺锌会造成生长发育缓慢，食欲不振等现象；锌参与众多蛋白质组成和酶的合成，缺锌会影响人体维生素A 的代谢，影响还原酶活性，使维生素A 的利用率降低[13]；锌对人体新陈代谢至关重要，有多种生物学作用，包括催化和调节功能，它还是多种酶合成的辅助因子[14]。锌元素是免疫器官胸腺发育的营养素，只有锌元素充足才能有效保证胸腺发育，正常分化T 淋巴细胞，促进机体细胞免疫功能。孕期胎儿生长发育需要摄入较多锌元素，因此孕妇是易缺锌人群，已经有研究表明，大部分孕妇均有锌缺乏的情况，特别是孕早期，孕妇必须通过生理调节来补充锌元素，以此来维持自身锌及胎儿的锌需求[15]。郭洪辉等[16,17]的研究表明罗非鱼鳞胶原肽螯合锌有抗氧化及抑菌活性，河豚鱼皮胶原寡肽螯合锌在体内外都有抗氧化活性，故选灰树花多肽作为锌螯合的原料。

近年来，关于灰树花多糖活性的研究已有较大突破，而对于灰树花多肽及其螯合物的研究相对较少，故本文对灰树花多肽-锌螯合物进行研究，并对其进行结构表征，进一步研究灰树花多肽-锌螯合物对孕期缺锌鼠后代的影响，为灰树花多肽进一步的研究利用提供理论根据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

灰树花，庆元县宏亿农业发展有限公司提供。

1.1.2 试剂

复合蛋白酶（活力≥120 U/mg），北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇（CH3CH2OH）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氢氧化钠（NaOH）、二硫腙、氯化锌（ZnCl2）、碳酸氢铵（NH4HCO3）、乙腈、甲酸等试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；锌离子检测试剂盒、碱性磷酸酶（AKP）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒等购于南京建成生物工程研究所。

1.1.3 仪器

低速离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；冷冻干燥机，河北国辉实验仪器有限公司；水浴恒温振荡器，常州精达仪器制造有限公司；红外光谱仪，美国Thermo Fisher 公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；X-射线粉末衍射机，荷兰飞利浦公司；SEM 场发射扫描电子显微镜，美国FEI公司；冷冻离心机，艾本德中国有限公司；离心浓缩仪，上海辅泽商贸有限公司。

1.1.4 试验动物

由福州吴氏动物中心提供，动物许可证号：SCXK(沪)2017-0005），选取8 周龄，体质量为（30±2）g，SPF 级的ICR 成年雌鼠，（每组8 只，同批次雄鼠每组8 只（仅供雌鼠受孕），一周适应期小鼠可以自由饮食饮水。生活环境温度20～25 ℃，湿度45%～55%，昼夜12 h 节律均衡。仔鼠每组随机选取雌雄仔鼠各8 只。

1.2 GPs-Zn 的制备

按照熊煜等[10]的方法提取得到GPs，配制GPs溶液（1 g/100 mL），ZnCl2溶液（0.02 mol/L），GPs溶液和ZnCl2溶液体积比为2.5:1，充分混合后调节pH 值为6.7，将GPs 与ZnCl2混合溶液置于47 ℃恒温水浴摇床中充分反应35 min。反应结束冷却至室温，加入体积分数95%乙醇洗涤静置过夜后离心（4 000 r/min，20 min）弃上清，将沉淀冷冻干燥得到GPs-Zn。用火焰原子吸收光谱仪测得GPs-Zn 的锌离子质量分数为9.41%。

1.3 GPs-Zn 的结构表征

1.3.1 电镜扫描（SEM）观察

扫描电子显微镜观察时，用导电胶将4 个GPs或GPs-Zn 样品粘到样品观察台，在高真空环境下用金喷溅镀膜，并分别用5 000×和10 000×的扫描电镜观察拍照。

1.3.2 X-射线粉末衍射（XRD）

取适量GPs 和GPs-Zn 分别磨成粉，以4°/min的扫描速度从5°扫描到90°，发射狭缝0.3 mm，防散射狭缝1°，然后通过X 射线衍射进行分析。

1.3.3 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）扫描

将1 mg 冻干的样品与100 mg 干燥的溴化钾（KBr）混合加载至红外光谱仪上，通过FT-IR 光谱红外分光光度计记录波长4 000 cm-1至550 cm-1红外光谱扫描图。

1.3.4 紫外（UV）光谱扫描

通过紫外分光光度计记录GPs 和GPs-Zn 在202～800 nm 波长范围的紫外光谱。

1.4 GPs-Zn 对小鼠后代的影响

1.4.1 动物分组及造模

动物实验中，正常饮食组饲料中锌离子质量分数30 mg/kg；缺锌饮食组饲料中锌离子质量分数0 mg/kg。根据中国营养学会推荐的锌离子摄入量及体表面积折算的等效剂量比值，结合实验前期的预实验结果，故拟定如下分组和仔鼠的灌胃剂量：

组1（CO）：正常孕鼠分娩的仔鼠，正常饮食，灌胃超纯水；

组2（ZD）：缺锌孕鼠分娩的仔鼠，缺锌喂养，灌胃超纯水；

组3（ZD+）：缺锌孕鼠分娩的仔鼠，正常饮食，灌胃超纯水；

组4（ZS1）：缺锌孕鼠分娩的仔鼠，缺锌喂养，灌胃高质量浓度GPs-Zn（150 mg/mL）；

组5（ZS2）：缺锌孕鼠分娩的仔鼠，缺锌喂养，灌胃低质量浓度GPs-Zn（50 mg/mL）；

组6（PF1）：正常孕鼠分娩的仔鼠，正常饮食，灌胃高质量浓度GPs-Zn（150 mg/mL）；

组7（PF2）：正常孕鼠分娩的仔鼠，正常饮食，灌胃低质量浓度GPs-Zn（50 mg/mL）。

1.4.2 生长发育的变化

记录实验小鼠的体重变化，饲喂7 周，从第3周小鼠单独喂养，开始称重。

1.4.3 血清指标的测定

小鼠禁食12 h 后，对其进行眼球取血，并将血液保存至含有抗凝剂的2 mL 离心管中，静置2 h 后置于4 ℃条件下离心10 min（3 000 r/min)，取上清液于-20 ℃冰箱保藏，用于测定血清中锌浓度，碱性磷酸酶活性和超氧化物歧化酶水平。

1.4.4 小鼠脏器指数的测定

小鼠麻醉处死后，取出胸腺和脾脏，去除其他组织，擦拭干净，称重并计算胸腺指数和脾脏指数。计算公式如下：

式中：

T——胸腺指数，%；

S——脾脏指数，%；

M0——小鼠体质量，g；

M1——胸腺质量，g；

M2——脾脏质量，g。

1.5 数据统计分析

试验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 11.0 软件对数据进行方差分析（ANOVA），同时进行LSD 检验。以P＜0.05 为有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 扫描电子显微镜（SEM）观察分析

扫描电子显微镜能够实现材料从纳米到毫米的跨尺度显微组织表征，因此，常用于元素组成的形态观察和定量分析[18]。SEM 在5 000 ×和10 000 ×条件下观察GPs 和GPs-Zn 的表面结构结果如图1 所示。在5 000 ×或10 000 ×两种倍数下，图中1a 和1b 所示，灰树花多肽与锌离子螯合前均呈片状结构，物质结构表面相对光滑，有孔状结构。而螯合后，如图1c 和1d 所示，GPs-Zn 的表面呈块状结构，物质结构呈大颗粒状聚集，表面粗糙且有小颗粒，可能是锌离子晶体，这与王晴晴等[19]蛋清多肽-铁螯合后表面粗糙不平并形成了团状颗粒聚集体，组织结构更加紧密结果相一致。加锌螯合反应后，物质的微观结构发生了改变。除了离子结合和配位结合外，螯合还被认为具有一定的吸附作用[20]。

图1 GPs和GPs-Zn的扫描电镜图Fig.1 SEM images of GPs and GPs-Zn

2.2 X-射线粉末衍射分析

图2 为GPs 和GPs-Zn 的X-射线衍射图谱。结果显示，GPs 和GPs-Zn 均有明显衍射峰，与GPs相比，GPs-Zn 图谱在衍射峰的角度和相对强度都存在明显差异，说明多肽与锌螯合后结构发生了改变。散射的X 射线的相位将在某些方向上增强，显示出与晶体结构相对应的独特衍射现象[21]。螯合后GPs 衍射峰相对强度与角度发生改变，可能是GPs的COO-、-NH2与Zn2+以离子键和配位键的形式结合导致晶体结构改变[22]。

图2 GPs和GPs-Zn的X-衍射图谱Fig.2 XRD patterns of GPs and GPs-Zn

2.3 红外光谱分析

由图3 可知GPs-Zn 的红外光谱图不同于GPs，表明了GPs 与Zn2+结合后结构发生了改变。与GPs红外光谱相比，GPs-Zn 在3 388 cm-1处有明显的波动。在红外光谱检测中，通常会通过1 650 cm-1附近是否有吸收峰，来判断吸收峰中是否存在C=O伸缩振动，以1 235 cm-1附近是否有吸收峰来判断羧酸的伸缩振动，以此说明金属螯合肽中是否含有-COOH 结构[23]。由上图可以看出在1 662 cm-1和1 244 cm-1处均有较强的吸收峰，表明多肽和锌离子之间相互作用的位点是C=O 和-COOH，这与杨静等[24]多肽螯合物的螯合反应推测相似。GPs-Zn在1 088 cm-1处也有明显的吸收峰，这种吸收峰位移和强度发生变化，可能是GPs 中的一些键与锌离子结合成GPs-Zn 的结果。

图3 GPs和GPs-Zn的红外光谱Fig.3 Infrared spectra of GPs and GPs-Zn

2.4 紫外光谱分析

图4 表明，GPs 和GPs-Zn 的紫外吸收光谱显示出明显的带移位。用紫外分光光度法可以分析物质的结构特征，螯合后样品的差异可以从位错和紫外吸收光谱强度的变化中进行分析[25]。紫外吸收光谱是由于价电子的跃迁产生的，用以推断物质的组成和结构等，当多肽与矿物质离子形成配合物的过程中，改变了产物跃迁所需的能量，从而影响其波长和吸收程度。GPs 和GPs-Zn 的紫外吸收光谱在波长250 nm 附近处均有一个吸收峰；GPs 的最大吸收峰在波长410 nm 附近，而GPs-Zn 最大吸收峰发生了转移，在波长250 nm 附近。这意味着GPs与Zn 离子结合可能是由于GPs 中的C=O，-COOH和-OH，-NH2与锌离子结合，诱导强度变化和紫外光谱中的红移，这与刘腾飞等[26]鸡皮胶原蛋白多肽锌发生螯合反应后，螯合物的最大紫外吸收波长发生了红移结果一致。波段红移和强度变化表明GPs与锌离子结合形成GPs-Zn[27,28]。

图4 GPs和GPs-Zn的紫外光谱Fig.4 UV of GPs and GPs-Zn

2.5 仔鼠体质量分析

由表1 和表2 看出在仔鼠出生3～7 周时雌雄仔鼠中ZD 组、ZD+组与空白组体质量相比有显著性差异。当仔鼠出生第7 周时雌鼠中，相比于空白组，ZD 组、ZD+组、ZS1 组体质量显著降低，雄鼠中ZD 组、ZD+组和ZS2 组体质量显著降低。相比于ZD 组，GPs-Zn 可将缺锌仔鼠体质量提高89.98%（雌鼠）和88.30%（雄鼠）。由表1 和表2 可知，雌鼠与雄鼠ZD 组体质量均低于CO 组、ZS 组和PF 组，ZS 组体质量均高于ZD 组体重，雄鼠平均体质量普遍高于雌鼠平均体质量。雌雄仔鼠中，灌胃GPs-Zn 对雌鼠体质量的增强效果更为显著，推测可能是雌鼠更能通过GPs-Zn 来缓解因缺锌而导致的体质量下降。通过灌胃GPs-Zn 可以改善仔鼠体质量，且相对于CO 组体质量改善效果显著。GPs-Zn 质量浓度为150 mg/mL 时效果最好，对仔鼠的体质量改善情况更加显著，GPs-Zn 质量浓度为50 mg/mL 时，仔鼠体质量虽有改善，但与正常仔鼠体质量仍存在显著差异。当正常饮食仔鼠灌胃GPs-Zn 体质量会明显异常于正常仔鼠。因此本实验说明，母鼠孕期缺锌，仔鼠出生后灌胃GPs-Zn高剂量组可以改善仔鼠体质量，帮助其恢复到正常水平，低剂量组体质量与CO 组仍存在显著差异。

表1 雌仔鼠体质量变化表Table 1 Weight change of female offspring

表2 雄仔鼠体质量变化表Table 2 Weight change of male offspring

2.6 仔鼠血清AKP 结果分析

如图5 所示，对仔鼠进行不同的灌胃处理，仔鼠血清AKP 会发生变化。锌是合成AKP 必需的金属离子，也是AKP 活性中心的组成成分和激活因子，其活性在一定范围内与锌含量密切相关[29]，是锌水平评价的敏感指标[30]。在缺锌状态时，AKP 释入血清，促使血清AKP 活性增加。用GPs-Zn 灌胃的ZS1 组和ZS2 组，缺锌仔鼠血清中的AKP 恢复至接近正常水平，与ZD 组相比，GPs-Zn 可将碱性磷酸酶（AKP）水平降低52.28%（雌鼠）和62.48%（雄鼠）。雌雄仔鼠中，灌胃GPs-Zn 对雌性仔鼠血清AKP 水平的影响更为显著，推测可能是雌鼠更能通过GPs-Zn 来缓解因缺锌而导致的血清AKP水平的升高。母鼠缺锌仔鼠正常饮食的ZD+组可以显著改善血清中AKP，但雄鼠与正常饲养仔鼠仍有显著性差异。结果表明，GPs-Zn 可以改善小鼠体内AKP 水平；通过摄入不同质量浓度的GPs-Zn 可以促使小鼠血清的AKP 恢复到正常水平，进一步说明GPs-Zn 具有良好的恢复仔鼠血清AKP 水平的作用，杨杰等[30]研究发现，小肽螯合锌可将缺锌小鼠血清AKP 活力降低约29.91%。因锌与AKP 合成密切相关，缺锌仔鼠血清AKP 活力增加，灌胃GPs-Zn 后，血清AKP 活力降低，表明GPs-Zn 可改善缺锌仔鼠血清AKP 水平。

图5 各组血清AKP对比图Fig.5 Comparison of serum AKP content in each group

2.7 仔鼠血清SOD 活力结果分析

如图6 所示，与CO 组相比，ZD 组和ZD+组血清SOD 活力显著降低，并且雄鼠与雌鼠间也有显著差异，GPs-Zn 喂养的仔鼠血清中SOD 活力显著提高，且与正常组相比，无显著差异。与ZD 组相比，GPs-Zn 可将缺锌仔鼠血清的超氧化物歧化酶（SOD）活力提高108.07%（雌鼠）和26.16%（雄鼠）。雌雄仔鼠中，灌胃GPs-Zn 对雌性仔鼠血清SOD 活力的影响更为显著，推测可能是雌鼠更能通过GPs-Zn 来缓解因缺锌而导致的血清SOD 活力的降低。超氧化物歧化酶存在于所有生物细胞中，能够催化超氧化物转化，通过摄入不同质量浓度的GPs-Zn 可以增加机体的SOD 活力，从而增强机体的抗氧化效果，蒋丽等[31]研究发现，多肽可将小鼠血清SOD 活力提高约11.72%，进一步说明GPs-Zn具有良好的提高机体抗氧化效果的作用。

图6 各组血清SOD活力对比图Fig.6 Comparison of serum SOD activity in each group

2.8 仔鼠血清锌浓度结果分析

如图7 所示，与CO 组相比，ZD 组小鼠血清锌浓度显著降低，并且雄性仔鼠锌浓度降低更加显著，表明母鼠孕期缺锌对雄性仔鼠的血清锌浓度影响更大。用GPs-Zn 喂养仔鼠可使仔鼠血清中锌浓度显著提高，且对孕期缺锌导致的仔鼠缺锌补锌效果非常显著，且无明显性别差异。与ZD 组相比，GPs-Zn 可将缺锌仔鼠锌浓度提高14.74%（雌鼠）和29.33%（雄鼠）。雌雄仔鼠中，灌胃GPs-Zn 对雄性仔鼠血清锌浓度的影响更为显著，推测可能是雄鼠更能通过GPs-Zn 来补充锌离子，缓解缺锌饮食而导致的血清锌浓度的降低。当GPs-Zn 质量浓度为50 mg/mL时，雄性仔鼠血清的锌浓度显著增强，且明显高于其他各组，低质量浓度GPs-Zn 对缺锌仔鼠补锌效果较好，这与陈铭[32]灌胃低质量浓度蛋白肽螯合钙的大鼠中血钙浓度高于灌胃中质量浓度的结果相一致，推测可能是低剂量螯合物更利于机体吸收；而高、低质量浓度对雌性小鼠锌浓度水平的改善作用无显著性差异，可以看出，螯合锌对于缺锌仔鼠的补锌效果优于正常喂养的仔鼠。进一步表明，GPs-Zn 具有很好的补锌效果，这与王紫旭[33]的海参锌螯合多肽可促锌吸收作用的研究结果一致，表明肽螯合锌对缺锌幼鼠补锌效果较为显著。

图7 各组小鼠血清锌浓度对比图Fig.7 Comparison of serum zinc content of mice in each group

2.9 仔鼠脾脏指数结果分析

由图8 可以看出，相比CO 组，ZD 组雌雄仔鼠的脾脏指数均显著降低，表明缺锌会对仔鼠脾脏的正常发育造成影响，而脾脏是机体的免疫器官，对机体的免疫力有很大影响[34]。缺锌影响脾脏的正常发育，从而进一步影响机体免疫力。孕期缺锌导致的仔鼠缺锌，仔鼠的脾脏指数显著降低，机体免疫力受到影响，灌胃GPs-Zn 可显著提高仔鼠的脾脏指数。与ZD 组相比，GPs-Zn 可将缺锌仔鼠脾脏指数提高40.28%（雌鼠）和43.22%（雄鼠），这优于刘银媛等[35]的大豆多肽可将小鼠脾脏指数提高约16.67%。雌雄仔鼠中，灌胃GPs-Zn 对雄性仔鼠脾脏指数的影响更为显著，推测可能是雄鼠更能通过GPs-Zn 来促进脾脏发育，缓解缺锌饮食而导致的脾脏发育受损。质量浓度为150 mg/mL 时，雄性仔鼠的脾脏指数显著高于CO 组，相对于ZD 组，GPs-Zn可提高仔鼠脾脏指数，且与仔鼠正常饮食的脾脏指数无显著差异。

图8 仔鼠脾脏指数分析图Fig.8 Analysis of spleen index of offspring

2.10 仔鼠胸腺指数结果分析

由图9 可知，相对于CO 组，ZD 组雌雄仔鼠的胸腺指数显著下降，胸腺也是机体较大的免疫器官，缺锌喂养也会对机体的胸腺发育造成影响。而对仔鼠灌胃GPs-Zn 可以显著增强仔鼠的胸腺指数，且高于正常仔鼠的胸腺指数水平，表明GPs-Zn 对仔鼠胸腺的正常发育有一定促进作用。与ZD 组相比，GPs-Zn 可将缺锌仔鼠胸腺指数提高78.69%（雌鼠）和87.55%（雄鼠），这优于刘银媛[35]的大豆多肽可将小鼠胸腺指数提高约42.86%。雌雄仔鼠中，灌胃GPs-Zn 对雄性仔鼠胸腺指数的影响更为显著，推测可能是雄鼠更能通过GPs-Zn 来促进胸腺发育，缓解缺锌饮食而导致的胸腺发育受损。在不同分组的雌雄仔鼠中，相对于雌性仔鼠，雄性仔鼠的胸腺指数整体较低。对于雌雄仔鼠而言，GPs-Zn均能将其胸腺指数恢复至正常水平。相对于ZD 组，GPs-Zn 可提高仔鼠胸腺指数，且与仔鼠正常饮食的胸腺指数无显著差异。

图9 仔鼠胸腺指数分析图Fig.9 Analysis of thymus index of offspring

3 结论

X-射线粉末衍射和扫描电镜结果表明了多肽和锌离子螯合成一种新的物质；红外谱图的对比发现肽链上的氨基和羧基参与了锌离子的配位；紫外光谱图发现，GPs-Zn 中多肽的羰基原子和锌离子结合，诱导紫外光谱的红移，表明GPs 与锌离子结合形成GPs-Zn。动物实验结果表明，在母鼠怀孕期间缺锌会对出生后的仔鼠造成一定的影响，GPs-Zn 可显著（P＜0.01）提高母鼠怀孕期间因缺锌导致减少的仔鼠血清中锌离子浓度和超氧化物歧化酶（SOD）活力，降低碱性磷酸酶（AKP）水平。此外，GPs-Zn还能显著（P＜0.01）提高仔鼠的脾脏指数和胸腺指数。