腊肉源酵母菌对发酵牛肉品质特性的影响

张秋会，孟高歌，王晗，曹淑萍，崔文明，祝超智＊，赵改名＊，李付强

（1.河南农业大学食品科学技术学院，河南郑州 450002）（2.荥阳市市场监管综合行政执法大队，河南荥阳 450100）（3.涟源综合试验站，湖南娄底 417000）

腌腊肉制品是中式传统肉制品的典型代表，是以畜禽肉及其可食副产物为原料，经腌制、干燥脱水、烟熏等工艺制作而成。传统风干类腌腊制品属于发酵类生制品，风味独特、肉色腊红、肥肉金黄、易制作、耐贮藏，广受消费者的青睐[1,2]。

我国腌腊肉历史悠久，种类繁多，由于各地加工地理环境、配料和工艺、消费习俗等的差异，形成了不同感官和风味的产品类型[3,4]。研究表明，长期风干发酵的产品微生物对其特性形成产生影响，而微生物多样性为肉制品发酵剂的开发及应用提供了无限的可能性。腌腊制品中微生物菌群主要为葡萄球菌、乳酸菌等细菌和酵母菌、霉菌[5,6]。在发酵过程中，不同种类微生物的发酵性能不同，可赋予产品不同的品质特性，并对产品风味、质地、口感以及贮藏特性等产生影响[4]。相关研究表明，乳酸菌主要是通过调节产品的pH 值，进而抑制腐败微生物的增长以及产品在贮藏过程中自发产生的不良反应，具有改善产品色泽与风味以及达到延长货架期的作用[7,8]。Liu 等[9]通过比较接种不同发酵剂后发酵香肠的理化性质、微生物菌落、TBARS、脂解、蛋白水解和挥发性风味化合物，指出酵母菌在风味形成和有效抑制脂质氧化方面的表现比乳酸菌相比的贡献更大。Peromingo 等[10]发现有些酵母菌可以防止肉制品中与赭曲霉毒素A 存在相关的危害。有选择地将酵母发酵剂添加到原料中并控制整个发酵过程，可以在降低发酵失败的风险的同时，提高产品的安全性和稳定性，使产品的最终感官价值得到提升。

但在作坊式传统手工腊肉制作过程中，由于生产条件的局限性，无法对产品中的微生物生长进行有效控制，导致产品菌落结构不同，不能保证产品的生物安全性，最终引起产品质量的下降，以及风味的改变[11,12]。而微生物发酵剂可以引起产品pH 快速下降、水分活度降低，同时与本土的非发酵微生物参与竞争，从而预防发酵肉制品中N-亚硝胺积累过多。Liao 等[13]在发酵鱼制品中接种植物乳杆菌120、酿酒酵母2018 和木质葡萄球菌135，降低了发酵液中的N-亚硝基二甲胺（NDMA）。因此通过适宜的肉制品发酵剂的开发应用提升传统腌腊制品品质和安全性越来越受到关注。

通过前期实验发现[14]，从四川绵阳腊肉、湖南腊肉、信阳腊肉中分离筛选纯化出多种优势酵母菌株，将菌株进行活化后进行条件筛选，发现季巴蒙毕赤酵母和汉逊德巴利酵母具有较高耐盐性、耐亚硝盐性、耐酸性，能够作为具有优良发酵性能的菌株应用到发酵肉制品的生产中。本实验进一步将这两种菌株作为发酵剂，接种到牛肉中，并制成发酵牛肉产品。通过对产品水分含量、水分活度、pH 值、蛋白质含量、质构及感官评价等指标的测定，对比分析发酵菌株发酵、空白组无菌株发酵腊肉和农家购买的腊肉品质，探寻各菌种对腊肉品质及安全特性的影响，筛选适合发酵牛肉制品生产加工，并且具有良好发酵特性的菌株，为腌腊肉制品微生物发酵剂开发及其应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料：牛腩（牛腹部肋条），购于河南伊赛公司；四川绵阳腊肉、湖南腊肉、信阳腊肉（均取自农家自制产品），-20 ℃冻结贮藏待测；河南信阳腊肉的季巴蒙毕赤酵母以及四川绵阳腊肉的汉逊德巴利酵母中提取的菌液（前期试验提取）。

1.2 主要试剂

盐酸萘乙二胺、亚铁氰化钾、冰乙酸、硼酸钠、对氨基苯磺酸、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、氢氧化钠，φ=95%乙醇（均为分析纯）NAs 混合标准溶液购自Sigma 公司。

1.3 仪器设备

BYXX-50 型烟熏炉：嘉兴艾博公司；AIRTECHSW-CJ-2FD 超净工作台；BINDER 可编程低温培养箱；HI 99163 便携pH 计：德国Hanna 公司；AL104电子天平梅特勒：托利多仪器（上海）有限公司；AQUALAB 水分活度仪；DMART System5，美国CEM 公司。

1.4 产品加工工艺

1.4.1 发酵牛肉制作基础配方

本实验设置处理组和对照组，腊肉基础配方见表1，其中高度酒为牛栏山二锅头（42°）：

表1 发酵牛肉加工配方（以1 kg原料肉计）Table 1 Fermented beef processing formula (in total raw muscle of 1 kg)

1.4.2 发酵牛肉加工工艺流程

发酵牛肉的工艺参考高伟[15]，并加以修改：

牛腩→修整（切条大小均一）→初腌→复腌→发酵→风干→包装

1.4.3 操作要点

（1）原料修整：将牛肉切成30 cm×20 cm×2 cm的块条。

（2）初腌：将食盐5%和花椒0.01%，八角0.005%混匀，放入锅内炒制；牛肉条放入无菌盆里，炒制的盐5%撒在牛肉条上，揉搓均匀，盖上盖子，腌制1 d（4 ℃）（以质量分数计）。

（3）复腌：加入高度白酒1%、白砂糖2%、小茴香粉0.2%、姜粉0.05%、大蒜粉0.2%、白胡椒粉0.05%、亚硝酸钠0.01%。每隔半天翻倒一次，使其腌透（4 ℃）（以质量分数计）。

（4）发酵：腌制好的肉放入新的无菌盆里，将前期实验所得菌液[14]离心（4 500 r/min）后倒出培养基，并用生理盐水进行洗涤，直至培养基洗涤干净，取离心管菌体沉淀，接种量为106CFU/g，30 ℃发酵48 h。

（5）风干：将发酵好的肉放入烟熏炉中，40 ℃烘干48 h，55 ℃烘干12 h。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 理化指标

发酵牛肉理化指标的检测见表2 所示。

表2 发酵牛肉理化指标的检测及方法Table 2 Determination and method of physicochemical indexes of fermented bee

1.5.2 质构

将发酵牛肉切成1 cm×1 cm×1 cm 大小的方块，使用P50 探头进行测定，TPA 参数为：初始力5 N，压缩比50%，测试速度：60 mm/min。测定项目：硬度（N）；内聚性（Ratio）；弹性（mm）；咀嚼性（mJ）。

1.5.3 N-亚硝胺类物质含量

N-亚硝胺类物质含量的测定参考国标中分散固相萃取（d SPE）-GC-MS/MS 方法进行。

GC 条件如下：进样量为10 μL；色谱柱为DBWAX（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度为250 ℃；升温程序：初始40 ℃，保持3 min，首先以10 ℃/min 从40 ℃升至110 ℃，随后以15 ℃/min从110 ℃升至200 ℃，最后以40 ℃/min 从200 ℃升至240 ℃。载气为高纯度氦气（99.999%），流速为25 mL/min；质谱连接线路温度为250 ℃。

MS/MS 条件如下：扫描模式为多反应检测扫描（MRM）；离子源为EI 源，电子能量为70 eV；离子源温度为230 ℃。各NAs 的保留时间、定量及定性指标如表3 所示。

表3 8种N-亚硝胺的保留时间、定量和定性离子Table 3 Parameters of eight VNAs and two internal standards determined by GC-MS

1.5.4 感官评价

邀请具有感官评价经验且经过发酵肉制品感官评定培训的食品专业20 名学生（男女各半），组成评定小组，在参与感官评价之前，先讲述本次感官评价标准及评价要点，从发酵牛肉中的滋味，色泽，风味，咀嚼性和总体可接受度进行评估。在感官评价过程中要求，每品尝一个样品，进行漱口，以免样品之间进行干扰，评定小组成员在评定过程种禁止交流。具体评定标准如下，见表4 所示。

表4 发酵牛肉感官评分标准Table 4 Sensory scoring standard of fermented beef

1.6 数据分析

实验组设置四川绵阳腊肉、湖南腊肉、信阳腊肉三种自然发酵腊肉为对照组；实验室发酵工艺制作添加发酵菌株实验组以菌株命名，未添加菌株为空白组。所有实验组均做3 组平行，实验结果用平均数±标准差表示。采用SPSS 22 统计软件进行统计学分析，数据间的分析采用单因素方差分析，显著性水平均设定为P＜0.05。实验结果使用Origin 2018 进行作图。

2 结果与分析

2.1 发酵牛肉产品指标

2.1.1 水分活度aw和水分含量

aw是对试样中的水的组成的测量，可以表征水与非水成分缔合强度，aw与微生物的生长率有好的相关性，低的水分活度会抑制微生物生长，有效抑制肉制品的腐败变质，是发酵肉制品的安全指标之一。

图1 是发酵牛肉产品的aw和水分含量结果。从图1 可知，空白组发酵牛肉的aw显著低于腊肉组（P＜0.05），有研究证明，不同的加工工艺与加工参数，会影响香肠的水分含量[16]。说明完善产品加工工艺以及产品加工环境，实现发酵肉制品的工业化生产，可以有效阻止细菌生长，延长产品的保质期。季巴蒙毕赤酵母组发酵牛肉的aw显著高于汉逊德巴利酵母组（P＜0.05），但两种菌株发酵组的水分含量没有显著性差异，但均显著低于信阳腊肉（P＜0.05）。并且菌株发酵组牛肉的水分含量低于其他所有对照组，其中季巴蒙毕赤酵母组发酵牛肉的水分含量，显著低于空白、湖南腊肉以及河南信阳腊肉组牛肉（P＜0.05）。两株菌株均在一定程度上降低了发酵牛肉的aw和水分含量，从而使发酵牛肉在贮藏过程中更不易因为微生物引起腐败变质，从而拥有更长的保质期，说明两株菌株均可以作为发酵剂应用于发酵牛肉的工业生产中。

2.1.2 pH 值

由表5 可知，季巴蒙毕赤酵母组发酵牛肉和汉逊德巴利酵母组发酵牛肉的pH 显著低于空白组牛肉（P＜0.05），这是由于季巴蒙毕赤酵母和汉逊德巴利酵母菌株在发酵过程中产酸造成的；季巴蒙毕赤酵母组发酵牛肉和汉逊德巴利酵母组发酵牛肉的pH 显著高于信阳腊肉、湖南腊肉（P＜0.05），猜测是由于自然发酵腊肉中存在的产酸微生物不止一种，可能还存在乳酸菌等产酸能力强的菌种，产品在生产时受菌株影响，故信阳腊肉的pH 较其他实验组最低。较低的pH 有利于提高产品的微生物安全性，两种酵母菌在发酵牛肉的pH 方面影响相差不大，均可以作为发酵剂应用到发酵肉制品的生产中。

表5 不同发酵菌株处理组及农家腊肉的理化数据Table 5 Physical and chemical data of different fermentation strains and farm bacon

2.1.3 蛋白质含量

由表5 所示，季巴蒙毕赤酵母组发酵牛肉和汉逊德巴利酵母发酵牛肉的蛋白质含量显著低于空白组牛肉和自然发酵腊肉（P＜0.05），添加汉逊德巴利酵母菌株发酵牛肉的蛋白质含量显著低于季巴蒙毕赤酵母组（P＜0.05），证明两株菌株均具有较强降解蛋白质的能力，且汉逊德巴利酵母菌作为发酵剂降解蛋白质的能力较季巴蒙毕赤酵母更强。而菌株发酵组牛肉蛋白质被降解，是由于在发酵过程中季巴蒙毕赤酵母和汉逊德巴利酵母会产生蛋白酶，从而催化蛋白质分解成小分子的多肽和游离氨基酸[17]，产生独特的风味物质，使发酵牛肉的蛋白质含量降低。但购买的市售河南信阳腊肉中蛋白质含量较高的原因可能是在自然发酵时有益菌需要与杂菌进行竞争，数目较少，活性较低。

2.1.4 亚硝酸盐的测定

随着人们对健康生活的追求，现在越来越排斥亚硝酸盐含量过高的肉制品，因为其可能形成能够致癌的亚硝胺，对人体造成损害，甚至死亡。但目前也有研究认为硝酸盐的摄入对人体健康会产生有益影响[18]。而发酵肉制品中亚硝酸盐有人为添加与生产产生两个来源[19]。如表5 所示，季巴蒙毕赤酵母组发酵牛肉、汉逊德巴利酵母组发酵牛肉和空白组牛肉的亚硝酸盐含量不具有显著差异性（P＞0.05），但显著高于自然发酵腊肉（P＜0.05）。这可能是由于农家腊肉的生产中并没有添加亚硝酸盐，而季巴蒙毕赤酵母、汉逊德巴利酵母和空白组牛肉添加了亚硝酸盐造成的。

2.1.5 质构的测定

发酵牛肉的质构特性与口感息息相关。由表6所示，接种季巴蒙毕赤酵母和汉逊德巴利酵母的两组发酵牛肉的质构在硬度和咀嚼性两个方面具有显著性差异（P＜0.05），而在内聚力和弹性方面差异性不显著（P＞0.05）。与空白组牛肉相比，季巴蒙毕赤酵母组发酵牛肉和汉逊德巴利酵母组发酵牛肉的硬度显著升高、内聚力显著下降、咀嚼性降低（P＜0.05），这可能是在发酵过程中产酸降低了产品的pH，使蛋白质变性，导致产品的保水性降低，从而使结构更加紧密、咀嚼性降低。其中，季巴蒙毕赤酵母组发酵牛肉的硬度为18 476.37 N，内聚力为0.62 Ratio，弹性为0.67 mm，咀嚼性为6 928.53 mJ。与自然发酵腊肉相比，季巴蒙毕赤酵母组发酵牛肉的硬度降低、弹性增大，汉逊德巴利酵母组腊肉的内聚力更大、弹性更大，这代表着季巴蒙毕赤酵母菌株、汉逊德巴利酵母菌株用于发酵肉制品会带来更好的嚼劲，满足消费者对口感的需求。

表6 不同发酵菌株对牛肉质构影响及农家腊肉的质构Table 6 Effects of different fermentation strains on the texture of beef and farm cured meat

2.1.6 色泽的测定

肉制品色泽是消费者对肉色质量的第一印象，也是消费者对肉品质量进行评价的主要依据，红润的颜色会极大的增强消费者的购买欲[20]。相关研究证明，酵母菌具有脂解和蛋白质水解活性，有助于发酵肉制品颜色的稳定[21,22]。

不同组的腊肉的L*值（亮度），a*值（红度），b*值（黄度）值如表7 所示：汉斯德巴氏酵母组发酵牛肉和季巴蒙毕赤酵母组发酵牛肉的a*显著高于四川腊肉、湖南腊肉（P＜0.05），这是由于两种菌株含有亚硝酸盐还原酶，将产品中NO3-还原为NO2-，进而分解为NO，并与肉中的肌红蛋白结合转化为亚硝基肌红蛋白，使肉制品呈现鲜亮的红色；L*显著高于信阳腊肉（P＜0.05），这可能是因为两株菌株在发酵过程中引起发酵肉的水分含量与水分活度减小，导致发酵肉变得干燥，从而使发酵肉亮度降低、色泽消失。而四川腊肉和湖南腊肉的红绿值（a*）显著低于其他组，四川腊肉的黄蓝值（b*）显著高于其他组，可能是因为所使用原料、发酵以及干燥方式的不同造成的。与农家腊肉相比，单一菌株发酵组发酵牛肉的色泽显著接近空白组牛肉，说明汉斯德巴氏酵母菌和季巴蒙毕赤酵母菌作为发酵剂用于发酵肉制品拥有更接近鲜牛肉的色泽，因此两株菌株作为发酵剂应用于发酵肉制品工业生产中，可以使发酵牛肉具有更加优异的色泽。

表7 不同发酵菌株对牛肉色泽影响及农家腊肉的色泽Table 7 Effects of different fermentation strains on the color of beef and the color of farm cured meat

2.1.7 N-亚硝胺含量测定

亚硝胺具有较强的致癌性[23]，其中常见的有如N-二甲基亚硝胺（NDMA）和N-二乙基亚硝胺（NDEA）[24]。有研究指出，大约有300 种不同的N-亚硝胺类化合物拥有直接或间接的致癌性并在整个人类环境中广泛存在[25]。尤其是N-亚硝胺类物质：N-亚硝基二甲胺（N-Nitrosodimethylamine，NDMA）、N-亚硝基甲乙胺（N-Nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-亚硝基二乙胺（N-Nitrosodiethylaminen，NDEA）、N-亚硝基吡咯烷（N-Nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亚硝基吗啉（N-Nitrosomorpholine，NMOR）、N-亚硝基二丙胺（N-Nitrosodi-n-propylanime，NDPA）、N-亚硝基哌啶（N-Nitrosopiperidine，NPIP）、N-亚硝基二丁胺（N-Nitrosodibutylamine）[26]。N-亚硝胺的形成机理主要有两种，一是亚硝酸盐在酸性环境下转化为极不稳定的亚硝酸，然后快速转化为N-亚硝胺前体物N2O3，而N2O3与二级胺结合最终生成N-亚硝胺[27]。二则是在近中性条件下由一些微生物分泌出的细菌亚硝胺合成酶催化亚硝酸盐合成亚硝胺。研究发现，NDMA 生成量最高时发酵肉产品的pH 值为3.0 左右，pH 值过高或过低都将抑制NDMA 的生成[28]。较低的pH 值可使亚硝酸盐分解产酸[29]，也可促进有分解N-亚硝胺能力的乳酸菌生长。并且较低的pH 值可以使蛋白质氧化速率变慢，从而减少N-亚硝胺的生成量[30]。

不同的发酵牛肉制品的N-亚硝胺化合物含量如表8 所示，所有样品中NDMA、NMEA、NPYR、NMOR、NDPA、NPIP、NDBA 均未发现，只检测出NDEA。如表8 所示，单一菌株发酵组发酵牛肉中NDEA 含量显著低于空白组发酵牛肉及农家腊肉中NDEA 含量（P＜0.05）。有研究证明，酵母菌在发酵过程中降解亚硝酸盐[31]，减少了NDEA的前体物质产生，从而抑制了NDEA 的生成，这可能是季巴蒙毕赤酵母组发酵牛肉和汉逊德巴利酵母组发酵牛肉产品的NDEA 含量显著小于对照组牛肉的原因。湖南腊肉和信阳腊肉中的NDEA的含量明显高于实验制作的发酵牛肉，归因于传统的热烟加工过程中进行的热处理（60～80 ℃），以及在腌制和干制过程中操作不当，从而使NDEA含量高[32]，规范化操作和良好的生产环境会影响产品的品质。

表8 不同发酵牛肉的N-亚硝胺化合物含量Table 8 Content of N-nitrosamine compounds in different fermented beef

对比表5 发现，农家自制的自然发酵腊肉中，其亚硝酸盐含量明显低于空白组及单一菌株发酵组发酵牛肉的亚硝酸盐含量，但亚硝胺含量明显高于空白组及单一菌株发酵组发酵牛肉，这是可能因为在发酵过程中，发酵菌株发酵可以直接抑制亚硝胺的生成，并抑制亚硝酸盐分解，生成前体物质，从而提高产品的安全性。

2.2 感官评价

有研究报道，酵母具有出色的脂肪分解和蛋白水解能力，有助于发酵食品的香气化合物产生和感官质量改善[33,34]；由表9 可知，各组发酵肉产品在肉色、口感和气味方面具有显著性差异（P＜0.05），而在滋味和组织状态方面不具有显著性差异（P＞0.05）。季巴蒙毕赤酵母组发酵牛肉在肉色、口感和气味显著优于空白组牛肉（P＞0.05），在肉色与气味方面显著优于汉逊德巴利酵母组发酵牛肉（P＜0.05），在口感方面显著优于信阳腊肉（P＜0.05），在肉色、口感、气味等方面与四川腊肉、湖南腊肉不具有显著性差异（P＞0.05）。所以季巴蒙毕赤酵母菌作为发酵剂可使发酵肉制品的感官更加优异，达到与农家自制四川腊肉、湖南腊肉的优良感官性质相似的效果，有望作为发酵剂投入发酵肉制品生产。

表9 不同发酵牛肉的感官评价Table 9 Sensory evaluation of different fermented beef

3 结论

本研究以季巴蒙毕赤酵母和汉逊德巴利酵母为发酵菌株，用于牛肉发酵中。设置空白对照组在口感、色泽、质构、安全性方面进行对比分析。试验结果两株菌株单菌株发酵产品口感、质构明显高于传统产品；产品整体可接受性和传统腊肉相近；产品水分含量，pH 值与亚硝胺含量显著低于传统腊肉制品。结果显示两株菌株均作为牛肉发酵的发酵剂使用，用于提升发酵牛肉的品质、产品安全性。下一步继续探究其他菌株进行复配之后在发酵肉制品中的效果。