基于网络药理学对破格救心汤治疗急性心力衰竭主要活性成分及潜在靶点分析

张 明 李光智 林道斌

广州中医药大学附属海南省中医院心血管科一病区，海南海口 570203

急性心力衰竭（acute heart failure，AHF）是指急性发作的左心室功能障碍，导致心室充盈程度或射血能力受损的一组复杂临床综合征[1]，是本世纪心血管病学领域的两大难题之一[2]。

破格救心汤（Poge Jiuxin Decoction，PJD）由名老中医李可所创，是治疗AHF的临床经验方[3]。多项临床研究表明在AHF治疗过程中在西药的基础上加用PJD，往往能取得更好的疗效[4-6]。然而，由于PJD治疗AHF的药理作用机制尚未明确，这限制了该方的进一步推广。

为探讨PJD治疗AHF的机制，给进一步的实验室研究做好前期铺垫，本研究采用网络药理学方法，分析PJD治疗AHF的药物-化合物-靶点机制。

1 材料与方法

1.1 PJD活性成分和药物靶基因的筛选

由于PJD中高丽参或可以用人参及红参替代，所以本研究决定根据本课题组前期临床研究所使用的破格救心汤方药（干姜、附子、麝香、山萸肉、红参、炙甘草、磁石、生龙骨、生牡蛎），然后通过中药系统药理学数据库与分析平台，检索上述药物的活性成分和活性成分对应的基因。

1.2 AHF疾病基因的获取与交集基因的筛选

本研究通过GeneCards数据库寻找AHF的疾病基因并建立数据集，然后将疾病基因与1.1筛选出的活性成分对应的基因进行韦恩分析，获取交集基因。这些交集基因可能是PJD治疗AHF过程中所调控的基因。

1.3 交集基因中的核心基因筛选

通过STRING数据库建立交集基因的蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络（参数设置：a.物种限制为人类；b.隐藏游离点；c.设定置信度＞0.7；d.其他保持默认设置），对交集基因进行分析，筛选出核心基因。再将交集基因的蛋白互作网络数据导入Cytoscape软件（版本3.9.0）。运用Cytoscape软件中的插件分子复合物检测工具（Molecular Complex Detection tool，MCODE）（版本1.5.1）对蛋白互作网络中最显著的模块进行筛选和识别，其标准为MCODE评分＞5，截断度=2，节点评分截断度=0.2，k-score=2，最大深度=100。此外，本研究将差异基因PPI网络中Degree≥10的基因定义为核心基因，然后用Cytoscape插件cytoHubba识别核心基因。

1.4 交集基因的细胞功能注释分析与通路富集分析

利用R语言软件中的Bioconductor、clusterProfiler等程序包对交集基因进行细胞功能注释与通路富集分析，设置p value及q value均＜0.05为限制条件运行R语言脚本导出富集分析结果，再绘制柱状图展现细胞功能注释分析得到的生物学进程（biological processes，BP）、分子功能（molecular function，MF）以及细胞组分（cellular component，CC）结果；利用基因富集柱状图、通路信息图展示通路富集分析结果。

1.5 分子对接

为了验证活性成分与交集基因的作用关系，本研究还进行了分子对接验证。首先从PDB数据库（http://www.rcsb.org/）下载筛选的蛋白结构文件，活性成分三维结构通过Pub Chem数据库（https: pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得。在AutoDock Tools 1.5.6软件中对蛋白结构进行加氢去水处理，并保存为*pdbqt格式文件；然后将上述方法获得的活性成分文件和蛋白结构文件导入到AutoDock Tools软件中进行分子对接。

1.6 药物-活性成分-关键基因网络的建立

为了筛选PJD治疗AHF的关键活性成分，本研究将1.3得到的关键靶基因与其对应的药物活性成分，导入Cytoscape（版本3.9.0）软件建立药物-活性成分-靶点的相互作用网络关系图，并利用该软件中的CytoNCA插件分析网络节点的相关拓扑参数作进一步分析。

2 结果

2.1 PJD活性成分及药物靶点的筛选结果

本研究共找到121种PJD活性成分以及395个对应的药物靶基因。

2.2 疾病靶点及交集靶点的筛选结果

通过Gene Cards数据库检索到10 409个AHF疾病基因，与2.1获取的药物作用靶点进行韦恩分析，得到交集基因319个，为PJD治疗AHF潜在靶基因（图1）。

图1 药物靶点与AHF疾病靶点韦恩分析图

2.3 PPI和模块网络的构建及核心基因的选择

通过STRING数据库得到了交集基因的PPI网络模型，该模型共有节点318个，边5425条（图2A）。使用Cytoscape软件分析蛋白互作网络的拓扑结构，当Degree≥10时，从PPI网络中鉴定出10个核心基因，分别为胱天蛋白酶3（caspase-3，CASP3）、禽肉瘤病毒17的假定转化基因（Jun proto-oncogene，AP-1 transcription factor subunit，JUN）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、雌激素受体α（estrogen receptor 1，ESR1）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、低氧诱导因子-1A（hypoxia inducible factor-1A，HIF1A）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、丝氨酸/苏氨酸激酶1（aerine/threonine kinase-1，AKT1）（图2B）。

图2 PPI网络图

2.4 交集基因的细胞功能注释及通路富集分析结果

运用R语言软件对319个交集基因进行细胞功能注释（P＜ 0.05）得到1871种细胞功能条目，其中BP 7037种、MF 1262种、CC 609种。通路富集分析（P＜ 0.05）获得301条通路，富集基因最多的通路富集到了50个交集靶基因，富集基因最少的通路富集到了3个交集靶基因。

2.5 药物-活性成分-关键基因网络建立结果

本研究通过Cytoscape软件建立药物-活性成分-关键基因网络。在该图中有药物节点6个，活性成分节点有66个，靶点节点10个。在图中，方形代表关键基因，椭圆形代表活性成分，菱形节点代表药物节点。本研究发现作用到关键基因个数最多的前5个活性成分分别是槲皮素、山柰酚、谷固醇、柚皮素、人参皂苷-Rh2，在关键基因中，与活性成分相作用最多的关键基因是ESR1。见图3。且槲皮素与ESR1存在相互作用，所以本研究选择这对活性成分-关键基因作为分子对接研究对象。

图3 药物-活性成分-关键基因网络图

2.6 分子对接

结果发现本研究选择的槲皮素与ESR1的结合能≤-6.2 kcal/mol，当结合能＜-4.0 kcal/mol时，表明配体分子和受体结合良好[7]。见图4。

图4 分子对接图

3 讨论

本研究通过网络药理学的研究方法，发现破格救心汤治疗AHF的主要活性成分为槲皮素、山柰酚、谷固醇、柚皮素、人参皂苷-Rh2等，主要调控的关键基因为CASP3、JUN、VEGFA、IL-1β、TP53、ESR1、IL-6、HIF1A、TNF和AKT1。这些活性成分及靶点大部分都经过临床试验或动物实验验证对AHF有治疗效果。

槲皮素是黄酮类化合物。研究发现，槲皮素具有抑制细胞凋亡、改善细胞氧化应激、加强免疫力和抗炎等功能，摄入槲皮素能够改善心力衰竭预后[8]。Sharma等[9]发现使用槲皮素干预心力衰竭大鼠模型后，可以促进核因子红细胞系2相关因子2表达，从而增强抗氧化能力，达到改善大鼠心功能的目的。

关键基因方面，ESR1全称为雌激素受体，研究表明雌激素受体对心脏重塑有抑制作用。如雌激素受体敲除的小鼠会出现心肌肥厚的现象，进一步的心肌组织病理学检查后发现，雌激素受体下的心肌细胞结构紊乱，细胞间的连接出现异常[10]。此外，还有研究发现，雌激素受体可能会通过增强心肌细胞闰盘的稳定性抑制AHF，因为心肌闰盘是心肌细胞的连接处，它的稳定性是心肌收缩功能的基础，而雌激素受体基因表达的增加可以增强心肌细胞闰盘的稳定性[11]。IL-1β、IL-6、TNF都是炎症相关因子，AHF发生后会促进这些炎症因子的释放，加重炎症反应，而长时间的炎症刺激不但会促进心肌细胞凋亡加重心功能的损伤，还会促进心肌成纤维细胞增殖加速心肌纤维化导致患者预后不良[12]。CASP3是细胞焦亡的启动因子，激活的CASP3能够切割线粒体的特定站点以释放活动的N终端域，以及在质膜上穿孔以诱导细胞焦亡[13]。JUN的表达异常会促进心肌细胞凋亡，从而加速左室肥厚过程[14]。VEGFA会促进心肌成纤维细胞增殖，研究显示敲除VEGFA的小鼠较正常小鼠更容易出现心力衰竭。进一步的研究表明，VEGFA具有促进心脏毛细血管生成的作用，过表达VEGFA会通过促进新生血管，改善心肌供血，从而抑制心力衰竭[15]。TP53位于染色体17q13上，编码TP53蛋白质。过表达TP53会导致细胞生长停滞、细胞凋亡和细胞分化[16]。根据目前的研究结果，TP53对AHF的作用可能与其改善心脏重构有关[17]。HIF1A是由α亚基和β亚基构成的异源二聚体，HIF1A的表达上升会造成心肌细胞能量代谢异常，造成心肌收缩力下降[18]。AKT1具有抗心肌细胞凋亡的作用，过表达AKT1可提高心肌细胞抗凋亡能力从而缓解心脏重构[19]。

综上所述，本研究通过网络药理学的研究方法，找出了PJD治疗AHF的活性成分及关键基因，这些活性成分与基因间的相互作用可能是PJD治疗AHF的作用机制。网络药理学研究只是理论研究，研究结果需要进一步的实验验证，这将是进一步的研究目标。