新型镁合金对金黄色葡萄球菌生物学特性影响的体外研究

刘小荣 杨国清 梁文强 张玉娟 张鹏飞 张 静 章晓波 王勇平▲

1.甘肃省第二人民医院检验科，甘肃兰州 730000；2.兰州大学第一医院骨科，甘肃兰州 730000；3.南京工程学院材料工程学院，江苏南京 211167

金黄色葡萄球菌是一种容易形成生物膜的革兰氏阳性球菌，在相关黏蛋白介导作用下，可定植、黏附于植入物，如心脏瓣膜、骨科植入物等表面形成生物膜，一旦发生植入物感染，往往需要取出植入物、扩大清创、延长抗生素使用时间，给临床治疗带来极大的挑战[1-4]。植入材料镁合金是一种可降解金属材料，具有良好的生物相容性及生物可降解性，镁合金降解后产生的OH-和Mg2+具有抗菌的作用，降低了细菌的活力，然而新型镁合金Mg-3Nd-1Gd-0.3Sr-0.2Zn-0.4Zr对金黄色葡萄球菌生物学特性的影响尚无研究报道，故本研究探讨新型镁合金Mg-3Nd-1Gd-0.3Sr-0.2Zn-0.4Zr对金黄色葡萄球菌生物学特性的影响，从而为镁合金抑制金黄色葡萄球菌生物学行为提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

新型Mg-3Nd-1Gd-0.3Sr-0.2Zn-0.4Zr合金材料由南京工程学院提供。金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC25923）由甘肃省第二人民医院检验科提供。

1.2 主要仪器

赛默飞MK3酶标仪（上海蓓米尔生物科技有限公司）；DHP-9602 35℃恒温培养箱（上海左乐仪器有限公司）；LMQ.C-80E高压蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）；BSC-3FA2鑫贝西生物安全柜（山东博科生物产业有限公司）；ATB-new微生物鉴定及药敏分析仪（法国梅里埃生物有限公司）；单槽超声波清洗机（陕西凯德力环保科技有限公司）。

1.3 镁合金试样制备

将新型Mg-3Nd-1Gd-0.3Sr-0.2Zn-0.4Zr合金制成10 mm×3 mm圆柱状试样，用无菌去离子水冲洗干净，高压灭菌后备用。

1.4 金黄色葡萄球菌悬液制备

将金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC25923）干粉接种于哥伦比亚血琼脂平板，放入37℃恒温培养箱中培养18 h。挑取分纯好的单个金黄色葡萄球菌菌落分别配置0.5、0.6、0.7、0.8、0.9麦氏浊度菌悬液各18 ml。分别相当于1.5×108、1.8×108、2.1×108、2.4×108、2.7×108CFU/ml。

1.5 金黄色葡萄球菌增殖实验

实验分为实验组及对照组，各设3个复孔。实验组分别各吸取不同浓度金黄色葡萄球菌悬液3 ml加入含有镁合金试样的24孔培养板中；对照组分别将3 ml不同浓度金黄色葡萄球菌悬液加入不含有镁合金试样的24孔培养板。将培养板放入37℃恒温箱中培养1、3、5、7 d，取出培养板，用无菌枪将菌悬液吹打混匀，每孔吸取100 μl菌悬液转移至酶标仪中，在450 nm处读取各组菌悬液OD值。

1.6 金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验、溶血素实验、抗生素抑菌环实验

实验分为实验组（新型镁合金）及对照组（不含新型镁合金），各设3个复孔。实验组吸取金黄色葡萄球菌悬液3 ml加入含有镁合金试样的无菌玻璃试管中；对照组将3 ml金黄色葡萄球菌悬液加入不含有镁合金试样的无菌玻璃试管中。将试管放入37℃恒温箱中静置培养1、3、5、7 d，取出试管，将金黄色葡萄球菌菌悬液转种到哥伦比亚血琼脂平板，挑取单个菌落分别进行金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验、溶血素实验、抗生素抑菌环实验。

1.7 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行处理。计量资料用均数±标准差（）表示，行t检验，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金黄色葡萄球菌增殖实验

在同一时间点，不同浓度实验组OD值比对照组明显更低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）（表1）。在不同时间点，相同浓度实验组与对照组比较，OD值明显降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）（图1）。随着培养时间延长，相同浓度实验组与对照组OD值之差逐渐上升（P＜ 0.05）（图2）。

图1 金黄色葡萄球菌增殖实验

图2 金黄色葡萄球菌增殖实验

表1 两组金黄色葡萄球菌增殖情况（OD值）（）

表1 两组金黄色葡萄球菌增殖情况（OD值）（）

浊度1 d 3 d 5 d 7 d实验组对照组实验组对照组实验组对照组实验组对照组0.50.354±0.0080.554±0.0050.809±0.0051.269±0.0121.153±0.0051.919±0.0051.412±0.0162.334±0.010 0.60.433±0.0030.726±0.0071.005±0.0041.468±0.0051.356±0.0052.131±0.0111.731±0.0042.719±0.015 0.70.519±0.0650.884±0.0041.270±0.0051.735±0.0061.673±0.0082.496±0.0132.012±0.0063.092±0.006 0.80.551±0.0030.993±0.0061.328±0.0071.916±0.0061.759±0.0052.691±0.0062.105±0.0933.299±0.016 0.90.563±0.0031.142±0.0071.395±0.0122.178±0.0081.834±0.0063.027±0.0112.202±0.0173.665±0.012

2.2 金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验

与对照组比较，实验组凝集颗粒较小，且随着培养时间延长，凝集颗粒逐渐变小（图3）。

图3 金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验（光镜，40×）

2.3 金黄色葡萄球菌溶血素实验

与对照组比较，实验组β溶血环较小，且随着培养时间延长，β溶血环逐渐减弱，而且培养7 d后，β溶血环消失（图4）。

图4 金黄色葡萄球菌溶血素实验（光镜，40×）

2.4 抗生素抑菌环实验

与对照组比较，实验组所有抗生素在1、3、5、7 d抑菌环直径较大，差异有统计学意义（P＜ 0.05）（图5）。

图5 抗生素抑菌环实验

3 讨论

植入物感染诊治困难在于植入材料表面细菌生物膜的形成[5-8]，金黄色葡萄球菌在相关黏蛋白介导下，可定植、黏附于植入物表面，形成细菌生物膜[9-11]。

近年来，本研究课题组对系列镁合金进行研究，结果表明镁合金材料对成骨细胞具有良好的细胞相容性，对骨组织具有良好的组织相容性，对机体重要脏器具有良好的生物安全性[12-18]，Robinson等[19-20]研究表明镁合金在人体环境中降解后可杀死大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等常见细菌。本研究首先探讨镁合金对金黄色葡萄球菌增殖的影响，研究结果显示在同一时间点不同浓度实验组OD值比对照组明显更低；在不同时间点相同浓度实验组与对照组比较，OD值明显降低；随着培养时间延长，相同浓度实验组与对照组OD值之差逐渐上升，结果表明镁合金具有抑制金黄色葡萄球菌增殖的能力；随着细菌浓度的增加，镁合金抑制细菌增殖的能力也逐渐增加。研究结果还显示相同浓度对照组与实验组OD值之差在第5天之后逐渐减低，表明细菌的增殖能力逐渐降低。随后本研究探讨了镁合金对金黄色葡萄球菌血浆凝固酶、菌溶血素、抗生素抑菌等生物学特性的影响，研究结果显示随着培养时间延长，血浆凝固酶实验凝集颗粒逐渐变小；葡萄球菌溶血素（β溶血环）逐渐减小；各抗生素抑菌环直径逐渐增大，结果表明镁合金对金黄色葡萄球菌的生物学特性有明显的影响。

综上所述，新型Mg-3Nd-1Gd-0.3Sr-0.2Zn-0.4Zr合金具有抑制金黄色葡萄球菌增殖的能力；同时，镁合金还能抑制金黄色葡萄球菌血浆凝固酶凝集颗粒及β溶血环，增强抗生素抑菌环等生物学特性。