基于网络药理学探讨健脾温阳方治疗原发性早泄的作用机制

陈文铄 洪志明 陈子龙 韦 一 王胜杰 邱俊峰 翁浩伟

1.广州中医药大学第四临床医学院，广东深圳 518033；2.深圳市中医院男科，广东深圳 518033

原发性早泄（primary premature ejaculation，PPE）是指从首次性生活开始即有早泄（premature ejaculation，PE）。PPE为常见的男性功能阻碍性疾病，其特征是阴道内射精潜伏发展时期短，对患者心理健康造成影响[1]。PPE的病因和发病机制极为复杂，普遍认为是生物学和心理学影响因素共同作用的结果[2-3]。目前，现代医学治疗PE的药品有选择性5-羟色胺再摄取抑制剂、局部麻醉剂、磷酸二酯酶5抑制剂、α-受体阻断剂等[4-5]，但远期来看存在耐药性，并且存在恶心、头痛、眩晕等不良反应。PE在中医学归属于“臻疾”等范畴。中医学认为，PE与心、肝、肾密切相关，其志在心，其藏在肾，其行在肝[6]。既往研究表明，健脾温阳方配合西药治疗PPE有一定临床疗效[7]。健脾温阳方是深圳市中医院男科自拟方，其组成包含麸炒枳壳、当归、肉桂、黄芪、麸炒白术、北柴胡、陈皮、升麻、甘草片、淫羊藿、土鳖虫、车前草、浮小麦共13味中药，具有益气健脾、补肾助阳的功效。然而，健脾温阳方治疗PPE的具体作用机制尚不明确，有待进一步探究。本研究利用网络药理学的方法探究健脾温阳方与PPE的具体作用机制，以期更好地指导临床。

1 资料与方法

1.1 健脾温阳方药物作用靶点收集

经过中药系统药理学数据库与分析平台（The Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）、中药分子机制的生物信息学分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM）应用操作平台进行药品有效成分筛选，搜索健脾温阳方13味中医药的化学活性有效组分，并且挑选出其主要作用目标靶点，使用Uniprot数据库将收集到的所有活性成分对应的目标靶点转化为相互对应的遗传基因名称。

1.2 PPE疾病靶点收集

经过多种数据信息库来搜集疾病目标靶点，以“primary premature ejaculation”为关键词进行搜索，收集目标靶点，同时把2个数据库的最终处理结果删重合并处理。将有效组分目标靶点和疾病目标靶点取交集，绘制韦恩图。

1.3 “健脾温阳方药物活性成分-PPE疾病靶点”网络的绘制

将健脾温阳方的药物有效活性成分靶点和PPE的主要作用目标靶点展开交集探究解析，参考依据运算度数值（degree），使用Network Analyzer筛选出健脾温阳方的有效活性成分。

1.4 “健脾温阳方药物活性成分-PPE疾病靶点”蛋白质相互作用（protein-protein interactions，PPI）网络的构建

应用STRING数据库（https://string-db.org），针对以上活性成分目标靶点和PPE目标靶点交集后的合计目标靶点展开PPI网络的建立，运用Cytoscape和ECODE程序排版利用插件对PPI网络开始中心性解析。

1.5 “健脾温阳方药物活性成分-PPE疾病靶点”的基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集解析

将交集靶点录入DAVID数据库，进行GO和KEGG解析，分别根据P值筛选排名前10和前20的数据导入生信盒子软件绘制图。

2 结果

2.1 健脾温阳方药物作用靶点收集

通过TCMSP平台检索出健脾温阳方中11味药物的活性成分，黄芪有20个活性成分，白术有7个活性成分，北柴胡有17个活性成分，陈皮有5个活性成分，升麻有17个活性成分，甘草有92个活性成分，枳壳有5个活性成分，当归有2个活性成分，肉桂有2个活性成分，淫羊藿有23个活性成分，车前草有10个活性成分；通过BATMAN-TCM平台补充检索另外2味药品的化学活性有效组分，土鳖虫有1个化学活性有效组分，浮小麦有1个化学活性有效组分。删减重复项，使用Uniprot数据库对化学活性有效组分目标靶点蛋白展开遗传基因名称转化处理，并且获取434个目标靶点。

2.2 PPE疾病靶点收集

共获得191交集靶点个，见图1。

图1 药物-疾病交集靶点图

2.3 “健脾温阳方药物活性成分-PPE疾病靶点”网络的绘制

运用Cytoscape对191个交集目标靶点绘制“活性成分-目标靶点”网络图，见图2。Network Analyzer运算研究分析获取344个控制节点，2458条边，参考依据度数值筛选前15的活性成分，见表1。

表1 度数值前15的活性成分

图2 13味中医药活性成分-目标靶点网络图

2.4 “健脾温阳方药物活性成分-PPE疾病靶点”PPI网络的构建

将191个交集靶点导入STRING数字库，调节最低要求互动分数为中置信度（0.4），获得对应的网络数据信息，将数据信息自动输入Cytoscape展开分析，最终结果获取190个控制节点，4088条边，见图3。运用ECODE程序应用插件能对遗传基因群，来展开蛋白聚类，在介数中心性、接近中心性、度中心性研究分析条件下进行中心性分析，结果筛选出20个核心靶点，见图4，核心网络中度数值前15的靶点见表2。

表2 度数值前15的关键核心靶点

图3 交集靶点网络图

图4 交集靶点核心网络分布图

2.5 “健脾温阳方药物活性成分-PPE疾病靶点”的GO和KEGG富集解析

将获取的各交集靶点利用DAVID进行GO富集解析。最终结论共获取760条生物过程（biological process）条目，包括对药物、外源性刺激、乙醇、雌二醇的反应等作用过程；90条生物细胞有效组分（cellular component）条目，包括质膜总体有效组分、突触前膜的构成部分、突触后膜、质膜、神经结构分布元投射等有效组分；150条分子功能（nolecular function）条目。参考依据遗传基因数目及差异性排序，绘制3个聚类分析前10的条目，见图5。

图5 交集靶点GO分析

将得到的交集靶点利用DAVID进行KEGG富集分析，结果中P＜ 0.05的通路有169条，根据校正P值排序前20条目见图6。主要富集于PI3K-Akt通路、cAMP信号通路等数字信号通路。

图6 交集目标靶点KEGG富集分析

3 讨论

中医药治疗PPE有悠久历史，相关临床研究表明，健脾温阳方联合盐酸帕罗西汀治疗PPE的中西医结合疗法是理想方案之一[8]。该疗法经过临床观察后发现，与单独使用帕罗西汀相比，该疗法能够提高患者的总有效率，延长患者的射精潜伏期，降低不良反应发生率。

本研究采取网络药理学对健脾温阳方治疗PPE的具体作用机制进行探讨，能一定程度上体现中医学“整体观念”的治疗理念。网络药理学结果显示，健脾温阳方治疗PPE的关键化学成分为槲皮素。槲皮素具有抗炎、抗氧化反应等生物学效应，能进而舒张血管，使阴茎硬度增大，射精阈值提高，还能够促进其收缩[9]。健脾温阳方治疗PPE的靶点基因有Jun、MAPK3、MAPK1、ESR1、FOS等。常晓茹等[10]研究表明，c-Jun氨基末端激酶高度表达会导致大鼠生殖系统的损伤，其机制可能是提高了睾丸线粒体氧化应激的水平，促使丝裂原激活作用MAPK数字信号通路中p38渠道。MAPK3受到丝裂原刺激后，处理上游传出的级联反应信号，使核内c-Fos、c-Jun等转录影响因子磷酸化反应处理，进而调节控制生殖细胞的增殖和分化[11]。与此同时，MAPK1和MAPK3作为是VEGF数字信号通路中的重点目标靶点，参与生殖过程[12]。ESR1对雄性生殖机能存在重要的作用，参与生殖器官的生长发育等过程，当ESR1缺损时，会导致离子转运和水重吸功能受损，从而使精子密度发生异常[13]。c-FOS蛋白存在于睾丸组织内，参加生殖细胞的分化，推动生精细胞的生长发育，促使精母细胞转化[14]。c-FOS原癌遗传基因的过度表达还常产生在促性腺激素应用在间质细胞引发睾酮激素分泌的过程中[15]。

健脾温阳方治疗PPE的关键通路是PI3K-Akt信号通路和cAMP信号通路。PI3K-Akt信号通路是由酶联受体介导的核心数字信号通路，具有多类生物学功能，对生物细胞生长发育繁殖、分化和凋亡起到重要应用[16]。在睾丸组织中，PI3K-Akt信号通路可以调节睾丸支持细胞的增殖、分化，包括精子的产生[17]。cAMP通路能够应用在阴茎海绵体平滑肌细胞离子通道来介导其舒张，当血流中前列腺素、血管化学活性肠肽和降钙素遗传基因相关多肽等物质进入阴茎海绵体生物细胞，促使细胞质内钙离子有效浓度减少，最后阴茎血实际流量增长而引发勃起行为活动[18]。与此同时，cAMP通过刺激腺苷酸环化酶/G蛋白体系就会形成cAMP，进而激活作用蛋白激酶，逐渐推动相互对应的睾酮自动形成酶合成增长，进而参加睾酮的生成[19]。

综上所述，本研究从多方位、多角度预测了健脾温阳方治疗PPE的作用机制，为研究健脾温阳方治疗PPE提供部分理论依据，但由于中药成分繁多，健脾温阳方应用于PPE的具体作用机制仍需进一步的临床试验探索，以保证其有效性和安全性。