热休克蛋白在肌萎缩侧索硬化症中作用的研究进展

罗茂涛 张倩倩 赵慧慧 程曦 牛琦

【摘要】肌萎缩侧索硬化症（ALS）目前仍面临发病机制不明及无有效治疗措施的困境，研究发现ALS中存在显著的蛋白稳态失调，包括蛋白质错误折叠和异常蛋白聚集体的形成，對ALS的起病及发展具有重要作用。其中，作为分子伴侣家族的热休克蛋白（HSP）因具有维持蛋白稳态、促进异常蛋白聚集体降解的作用而受到了越来越多的关注。

【关键词】肌萎缩侧索硬化症；蛋白质稳态；热休克蛋白；热休克反应；治疗

【中图分类号】R651【文献标志码】A【文章编号】16727770（2024）02022004

Progress on role of heat shock proteins in amyotrophic lateral sclerosis LUO Maotao， ZHANG Qianqian， ZHAO Huihui， et al. Department of Geriatric Neurology， The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 210024， China

Corresponding author： NIU Qi

Abstract： At present， the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis（ALS） is still unclear and there is no effective treatment. Studies have found that there are significant protein homeostasis disorders in ALS， including protein misfolding and the formation of abnormal protein aggregates， which play an important role in the occurrence and development of ALS. As a family of molecular chaperones， heat shock proteins（HSPs） have received increasing attention due to their roles in maintaining protein homeostasis and promoting the degradation of abnormal protein aggregates.

Key words： amyotrophic lateral sclerosis； protein homeostasis； heat shock protein； heat shock response； treatment

肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种以上下运动神经元丢失和肌肉萎缩为特征的进行性致死性神经退行性疾病。迄今为止，已超过40多个基因被报道与ALS相关，如SOD1、 TDP43、C9ORF72等［12］。目前ALS发病机制仍不明确，近年来的研究发现，蛋白质的异常沉积及蛋白质稳态失调与ALS发病密切相关［3］，蛋白质稳态对于维持正常的细胞代谢及细胞对刺激的应答做出动态反应至关重要。其中，热休克蛋白作为调控蛋白质稳态的重要分子之一，在诱导错误折叠蛋白重新折叠、促进其降解等方面的重要作用受到越来越多的关注。

1蛋白质稳态

组织及细胞功能的最佳状态需要良好的蛋白质稳态（protein homeostasis），而稳态的平衡依赖于细胞内蛋白质质量控制（protein quality control，PQC）系统的调节，主要包括分子伴侣和降解系统。其中，分子伴侣是蛋白质稳态维持最主要的参与者，能调节蛋白质合成、折叠、转运等多个过程［4］。

1.1热休克蛋白热休克蛋白（heat Shock protein，HSP）是最重要的一类伴侣蛋白，根据其大小、结构及功能进行分组［5］，目前主要分为HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和sHSPs等HSP家族。HSP是抵抗蛋白质错误折叠及聚集的第一道防线。作为一类重要的分子伴侣，HSP不仅发挥伴侣活性，通过与新生蛋白质相互作用，帮助稳定蛋白质并正确折叠成有效的构象；同时，HSP能启动错误折叠蛋白质重新折叠或结合在这些蛋白质所暴露的黏性疏水区域，以阻断它们互相作用和聚集［4］。此外，HSP还参与了自噬及蛋白酶体系统等降解过程［6］，清除已经形成的蛋白质聚集体。因此，HSP的抗蛋白质聚集作用在蛋白质稳态的维持中起了相当关键的作用。

1.2热休克反应细胞内存在一种非常重要的内源性应激保护机制，即热休克反应（heat shock response，HSR），受热休克因子1（heat shock factor1，HSF1）的调控。热应激、蛋白质毒性等能诱导HSR发生，激活HSF1，脱离与之结合的HSP90，形成三聚体HSF1。HSF1的靶基因启动子区域有一段非常保守的DNA序列，称为热休克元件（heat shock element，HSE），三聚体HSF1从胞质转运至胞核并与HSE结合，促进多种HSP基因表达上调，协同发挥作用，共同维持蛋白质稳态［7］。

2ALS的HSP失调

HSP存在于神经元的多个亚细胞结构，参与了蛋白质的合成、正确折叠、降解、解聚等过程，维护神经元内的蛋白质稳态。然而既往不少研究观察到了ALS模型HSP的变化，如在SOD1G93A小鼠的脊髓组织匀浆中， HSP105水平出现降低［8］。最近，一项死后散发型ALS尸检研究中，也发现了HSPA8、HSP40/70等HSP表达下降［9］。这些变化说明了HSP的改变与ALS的发病存在关联。HSP的失调可能通过影响蛋白质稳态导致疾病的发生，因为在ALS患者或模型发现了多种蛋白质聚集体（aggregates），如mSOD1（superoxide dismutase 1）蛋白聚集体，几乎存在于所有散发型ALS中的泛素及TDP43（TAR DNA binding protein 43）阳性包涵体［10］，多聚二肽重复蛋白（dipeptide repeat proteins，DPRs）［11］等，这是蛋白质稳态失衡的特征表现之一。

2.1HSP功能失调聚集体的存在通常被认为对神经元有毒性作用，核内聚集体可以干扰DNA转录或RNA加工过程。胞质内聚集体可以影响细胞膜的完整性、损伤线粒体功能、损害自噬作用等［10］。然而，有观点认为，这些聚集体可能是PQC在处理蛋白质错误折叠时的副产物，或者它们可能代表细胞的一种保护方式，即隔离和存储这些有毒蛋白质。但聚集体的存在说明，HSP可能无法阻止错误折叠蛋白聚集。一方面突变蛋白与HSP的作用模式发生改变，使得突变蛋白更易聚集；Ryu等［12］研究发现，错误折叠蛋白的表达能引起HSP70/Hsc70与底物或共伴侣结合模式的动态改变，而这种改变可能与疾病的发生发展及早期病理有关；研究表明SODIA4V的突变能促进mSODI蛋白聚集倾向区域的暴露，但并不能促进HSP70识别基序的暴露，因此易形成mSOD1聚集体［13］。另一方面已形成的聚集体能“隔离”HSP的保护作用，有研究显示在一些突变SODI（mSODI）转基因小鼠模型和患者死后组织中，发现了聚集体与HSP共存现象［14］；近期的一项研究也显示，HSP能与SOD1的聚集核心发生相互作用［15］。HSP与聚集体的相互作用（共存）表明了HSP被转移到聚集体中，因此无法执行正常的“管家（housekeeping）”功能。此外，一些研究发现HSP的突变可能与ALS的发生存在关联，Simona等［16］在273例意大利非亲缘ALS患者的队列研究中，发现了两种HSPB1基因突变，对变异之一（p.Ala204Glyfs*6）进行功能分析，发现突变蛋白改变了HSPB1的动态平衡，与野生型蛋白形成一个稳定的二聚体，最终导致伴侣活性的丧失。最近，一项研究对166例中国ALS患者进行二代测序，筛选出3个HSPB1基因可能的致病性罕见错义突变［17］。

2.2HSR失调包括HSP70、HSP40、HSP90在内的一些HSP没有被上调， 这是许多mSOD1小鼠模型的特征之一［8］。其中，很重要的原因之一是HSR没有被有效诱导。目前已经认识到HSR在神经元中具有更高的诱导阈值。体外实验表明，大鼠脑切片受热应激（41～42 ℃，15～60 min）后，少突胶质细胞的HSP70及星形胶质细胞的HSP27表达增加，而神经元中未见HSP70或HSP27的表达增加［18］；一项对死后散发型ALS尸检的研究表明，HSR在脊髓运动神经元中失调，HSF1的靶基因表达下降［9］。目前研究认为，HSR失调可能的原因是HSF1无法被有效激活，而并非表达不足［9］。近期的一項研究也显示，在神经元中，ALS的致病蛋白，如mSOD1，是一种HSR的弱诱导剂［19］。不过另一项研究却发现，DPRs能有效激活HSR［20］。总之，神经元内HSR与聚集体的关系及内源性HSF1无法被激活的原因仍有待进一步的研究。

3HSP的抗ALS蛋白质聚集作用

大量研究已证实HSP能阻止ALS相关蛋白的聚集，维护蛋白质稳态，从而发挥神经元保护作用［2122］。目前HSP的抗蛋白质聚集作用可以归因于两点：（1）HSP减轻触发致病性聚集的早期异常蛋白相互作用，根据文献报道，HSP可以有效地延长聚集开始前的滞后期［23］，如果蛋白质聚集已经启动，则可延长聚集体的初级及次级成核，这些作用主要是通过结合聚集蛋白质所暴露的疏水残基来发挥作用；（2）HSP参与聚集体转运至降解系统进行降解［6］。

3.1小HSP的作用除了HSP70外，小HSP家族在抗蛋白质聚集作用也受到了越来越多的重视。既往研究显示，HSPB5（HSP27）和HSPB1（αBcrystallin）的过表达能够抑制SOD1聚集［24］，而更多的研究主要集中在HSPB8（HSP22）的抗蛋白聚集作用上。HSPB8是小HSP家族成员之一，主要通过分子伴侣介导的自噬（chaperone mediated autophagy，CMA）途径参与蛋白质稳态的维持。HSPB8能形成二聚体与HSP70及支架蛋白BAG3（BCL2associated athanogene）和E3连接酶CHIP结合，最终组成HSPB8+ HSP70+CHIP+ BAG3复合体，在微管组织中心形成自噬小体，吞噬并降解错误折叠蛋白。当CMA不足或受损时，HSP70和CHIP与辅助伴侣BAG1结合，形成HSPB8+HSP70+CHIP+BAG1复合体后将错误折叠的蛋白质靶向运送至蛋白酶体系统进行降解［25］。研究发现在疾病发病期间和疾病末期，HSPB8在转基因ALS小鼠模型和患者的脊髓标本中表达上调［26］，在病程短的患者侧束星形胶质细胞中也存在类似情况［27］，这种表达上调可能代表了细胞对错误折叠蛋白诱导的损伤反应，并增强这些存活运动神经元蛋白毒性应激的耐受性。HSPB8通过CMA途径，降解毒性蛋白，因此其表达水平的上调有助于从多种致病蛋白（mSOD1、TDP35/TDP25、DPRs）的ALS神经元模型中去除聚集的错误折叠蛋白［2122］。最近一项研究发现，过表达的 HSP8可以保护脑内突触可塑性和认知功能，该研究认为过表达的 HSP8可能通过调节经典功能通路和上游调控因子来促进突触可塑性［7］。

3.2HSR的作用HSF1能介导HSR，而神经元中的HSR具有更高的激活阈值，其中原因之一是HSF1不能被有效激活。因此，HSF1的激活及随后的多种HSP表达上调能促使错误折叠重新折叠、解聚或通过自噬或泛素蛋白酶体系统（ubiquitinproteasome system，UPS）被清除，阻止毒性聚集体的形成及随后的神经损伤。既往研究表明，活性HSF1过表达能增强mSOD1H46R/H48Q小鼠的HSR，表现为小鼠脊髓提取物中可溶性的HSP70及不溶片段中HSP70及HSPB5的增加，并显著抑制小鼠体质量减轻，延迟ALS疾病的发病，该研究认为HSF1的过表达可能改变了SOD1的溶解性，改善了运动神经元的蛋白质稳态［28］。Wang等［29］的研究显示，HSF1能抑制TDP43乙酰化模拟物所致的病理过程，该研究认为通过诱导HSP27/40的表达，对蛋白质进行重新折叠或降解来减少TDP43聚集体，而内源性HSF1的激活足以发挥这种作用。由此可见，HSF1的激活能使HSR增强以及多种相互作用的关键HSP表达上调，比单一过表达某种HSP的抗聚集作用更强。最近一项研究则发现，相比于正常衰老的小鼠，长寿的小鼠可能保存和加强了大脑中HSF1的激活［30］，印证了HSF1激活的神经保护作用。

4治疗

聚集体的毒性作用很可能是导致ALS中神经变性的重要分子机制之一。而HSP在蛋白平衡网络中起着至关重要的作用，它们在蛋白质应激下被上调，因此是受调控的。

目前一些研究涉及了对单个基因调节的治疗作用。如调节HSPB8基因表达的药物：秋水仙素、雌激素受体调节剂等。其中秋水仙素以HSPB8依赖的方式增强不溶性TDP43聚集物的清除，目前正在对一大批ALS患者进行Ⅱ期临床试验［31］。

与单独上调HSP相比，作用于HSF1并上调HSR从而增加一系列应激相关蛋白的表达似乎更有能力减轻蛋白质聚集负荷，防止神经退化，延长ALS模型小鼠的寿命。目前已研究的药物有两类：一类治疗药物能激活HSF1和/或上调HSR下游产物。这些药物包括醉茄素A、阿莫洛莫（arimoclomol）等，能上调HSR促使存活运动神经元的数量增加，并延长mSOD1表达小鼠的寿命［14］。另一类治疗药物是针对HSF1抑制复合物，如17AAG，可上调HSP70表达，减少HEK293T细胞中过表达易聚集的TDP43 C末端片段的病理性聚集体的数量［32］。

羟胺衍生物阿莫洛莫是一种HSR共诱导剂，能稳定处于活化状态的HSF1，延长HSF1与HSE的结合时间，并上调一些HSP家族的表达［33］。在ALS的SOD1G93A小鼠模型中，阿莫洛莫已被證明可以延缓疾病进展，延长寿命，增加肌肉功能，并防止突变SOD1的聚集［34］。此外，最近一项研究表明，阿莫洛莫能增强HSR并改善mVCP小鼠脊髓和脑中ALS/FTD样病理特征，并防止神经元丢失［35］。虽然阿莫洛莫第二阶段200 mg每日3次剂量的安全性和耐受性试验获得成功［36］，但在一大群散发ALS 参与者中进行的3期研究未显示任何益处。因此，为了确定阿莫洛莫的作用是否可以在SOD1介导的疾病中得到最充分的体现，可能需要进行一项针对携带mSOD1患者的更大规模试验。

5总结与展望

蛋白平衡紊乱及随后发生的蛋白聚集是ALS的普遍特征。虽然蛋白质聚集与神经元功能障碍和死亡之间存在很强的相关性，但它们之间的关系及机制仍然是该领域的最大问题之一。很明显，蛋白质稳态崩溃是蛋白质聚集的关键部分，而HSP广泛参与蛋白稳态的调节，其功能下降或缺失及作用模式改变都会导致蛋白质稳态失衡，最终引起蛋白质聚集及随后的神经变性。在ALS环境中，HSP的表达与细胞存活有关，通过增加HSP水平可以增强蛋白质稳态网络的能力仍是未来研究的一个重要领域。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

［参 考  文  献］

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