右美托咪定对神经元氧糖剥夺/复氧损伤的保护作用

张雅瑞 侯庆明

［收稿日期］2022-05-23;  ［修訂日期］2023-02-17

［基金项目］国家自然科学基金资助项目（8217051911）

［第一作者］张雅瑞（1997-），女，硕士研究生。

［通信作者］侯庆明（1969-），男，博士，教授，博士生导师。E-mail：qingminghou69@gmail.com。

［摘要］  目的

探讨右美托咪定（Dex）对皮质神经元氧糖剥夺/复氧（OGD/R）损伤的神经保护作用及其可能机制。

方法  培养孕18 d的SD大鼠胎鼠皮质神经元细胞，随机分为对照组（Sham组，加入有糖细胞外液置于正常培养箱中培养）、模型组（OGD/R组，加入无糖细胞外液，置于37 ℃厌氧箱中培养制备OGD/R细胞模型）、阳性药物对照组（OGD/R+LW6组，OGD/R模型细胞加入1 mmol/L的LW6处理1 h）、OGD/R+低浓度Dex组（OGD/R模型细胞加入0.1 μmol/L Dex处理1 h）、OGD/R+高浓度Dex组（OGD/R模型细胞加入1.0 μmol/L Dex处理1 h）。应用CCK-8比色法、免疫荧光方法检测各组细胞的存活率，Western blot方法检测各组低氧诱导因子1α（HIF-1α）、激活转录因子-6（ATF-6）及下游靶点C/EBP同源蛋白（CHOP）的表达水平。

结果  CCK-8比色及免疫荧光染色结果显示，各组神经元存活率差异有显著性（F=63.46，P<0.05）；两两比较显示，OGD/R组神经元存活率较Sham组显著降低（P<0.05），OGD/R+高浓度Dex组神经元存活率较OGD/R组显著提高（P<0.05）。Western blot结果显示，各组神经元HIF-1α、ATF-6、CHOP蛋白表达差异有显著性（F=80.30～155.36，P<0.05）；两两比较显示，OGD/R组HIF-1α、ATF-6、CHOP蛋白表达较Sham组升高（P<0.05），OGD/R+高浓度Dex组HIF-1α、ATF-6、CHOP蛋白表达较OGD/R组降低（P<0.05）。

结论  Dex通过抑制HIF-1α表达对OGD/R损伤的神经元模型发挥保护作用。

［关键词］  右美托咪定；低氧诱导因子1α；氧糖剥夺/复氧损伤；激活转录因子6；神经保护

［中图分类号］  R338.2

［文献标志码］  A

［文章编号］  2096-5532（2024）01-0012-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.004

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］  https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240228.1250.001;2024-03-01  17：30：08

Protective effects of dexmedetomidine against neuronal oxygen-glucose deprivation/reoxygenation injury

＼ ZHANG Yarui， HOU Qingming

＼ （Qingdao University  Institute of Neurodegeneration And Neurorehabilitation， Qingdao 266071， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the neuroprotective effects of dexmedetomidine （Dex） against oxygen-glucose deprivation/reoxygenation （OGD/R） injury of cortical neurons and its possible mechanism of action.

＼ Methods＼ The cortical neurons of fetal Sprague-Dawley rats （gestational age， 18 d） were cultured and then were randomly divided into sham group （cultured in a sugar-containing medium in normal incubator）， OGD/R group （cultured in a sugar-free medium in an anaerobic incubator at 37 ℃ to prepare a neuronal OGD/R injury model）， OGD/R+LW6 group （OGD/R neurons treated with 1 mmol/L LW6 for 1 h as a po-

sitive control）， OGD/R+low-concentration Dex group （OGD/R neurons treated with 0.1 μmol/L Dex for 1 h）， and OGD/R+high-concentration Dex group （OGD/R neurons treated with 1.0 μmol/L Dex for 1 h）. The survival rate of cells was determined by co-

lorimetric assay with Cell Counting Kit-8 （CCK-8） and immunofluorescence assay. The expression levels of hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α）， activating transcription factor 6 （ATF-6）， and the downstream target C/EBP homologous protein （CHOP） were mea-

sured by Western blot.

＼ Results＼ According to CCK-8 and immunofluorescence assay results， there was a significant diffe-

rence in the survival rate of neurons between the groups （F=63.46，P<0.05）. Pairwise comparison showed that the survival rate in the OGD/R group was significantly lower than that in the sham group （P<0.05）; and the survival rate of the OGD/R+high-concentration Dex group was significantly increased compared with that of the OGD/R group （P<0.05）. Western blot results showed significant differences in the expression of HIF-1α， ATF-6， and CHOP proteins （F=80.30-155.36，P<0.05）. Pairwise comparison showed that the expression of HIF-1α， ATF-6， and CHOP was significantly higher in the OGD/R group than in the sham group （P<0.05）; and the OGD/R+high-concentration Dex group showed significantly lower expression of HIF-1α， ATF-6， and CHOP compared with the OGD/R group， the differences are statistically significant （P<0.05）.

＼ Conclusion＼ Dex inhibits HIF-1α expression to exert protective effects in the neuronal model of OGD/R injury.

［Key words］＼ dexmedetomidine; hypoxia-inducible factor-1alpha; oxygen glucose deprivation/reoxygenation injury; activating transcription factor 6; neuroprotection

腦卒中是一种全球发病率高、致残率高、死亡率高的脑血管疾病［1］，其中缺血性脑卒中占85%左右［2］。缺血性脑卒中发生时脑组织供血供氧突然中断，形成以神经元坏死为主的核心区及缺血半暗带［3-4］。氧供应中断和糖原消耗可引起神经功能的永久性缺陷［5］，同时也会使相应部位周围的神经元形成低氧状态。低氧诱导因子1α（HIF-1α）是细胞在低氧状态下的一种转录因子，HIF-1α通过对其下游靶基因的调控，在血管再生、炎症、细胞增殖分化及肿瘤生长等方面均起到重要的调节用［6］。HIF-1α的过度激活（持续高表达）可通过促凋亡途径导致细胞死亡，抑制HIF-1α的表达可能会减轻氧糖剥夺/复氧（OGD/R）损伤［7］。右美托咪定（Dex）是近年来应用于临床麻醉和镇静的新型、高选择性α2肾上腺素受体激动剂，具有镇静、镇痛、减轻炎症反应和应激反应保护器官等作用［8］。已有研究表明，Dex通过抑制HIF-1α的活性在心肌疾病中起着保护作用［9］，但在神经元损伤中的作用及其机制尚不明确。本研究探讨Dex能否通过抑制HIF-1α的表达降低内质网应激从而减轻OGD/R损伤所导致的皮质神经元损伤，为开发有效的OGD/R损伤治疗策略提供依据。

1  材料与方法

1.1  实验材料

SPF级、孕18 d的健康SD大鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，饲养于青岛大学医学部实验动物中心。主要试剂：Dex购自青岛大学附属医院，用9 g/L氯化钠溶液配制低浓度（0.1 μmol/L）和高浓度（1.0 μmol/L）的Dex溶液，置于4 ℃冰箱保存备用。细胞培养试剂neurobasal medium、B-27 Supplement、DMEM-H-Glucose、青霉素-链霉素（100×）、Trypsin-EDTA、HEPES-Buffer、glutaMax 100×均购自Gibco公司;胎牛血清购自四季青公司；CCK-8试剂盒购自北京Bioss生物技术有限公司；激活转录因子-6（ATF-6）及C/EBP同源蛋白（CHOP）购自Affinity抗体公司；β-actin购自武汉三鹰生物技术公司；HRP标记的兔来源的二抗购自北京索莱宝科技有限公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）、抗荧光淬灭封片剂（含DAPI）、蛋白磷酸酶抑制剂（All-inone，100×）购自索莱宝（北京）科技有限公司；兔来源抗HIF-1α多克隆抗体、兔来源抗Map2多克隆抗体、多聚赖氨酸均购自美国CST公司；LW6、RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2  实验方法

1.2.1  原代神经元培养  取孕18 d的健康SD大鼠，脱颈处死后取出胎鼠，用体积分数0.75的乙醇消毒后置于冰上。在光学显微镜下剥离颅骨、脑膜，机械分离大脑皮质，暂时放在DMEM培养液中。以900 r/min离心5 min，弃掉上清，加入0.5 g/L胰蛋白酶消化20 min，加入胎牛血清培养液终止消化；以900 r/min离心5 min，弃掉上清，再加入无血清培养液（neurobasal medium 50 mL、B-27 Supplement 1 mL、gluta Max 100× 0.5 mL、青霉素-链霉素（100×）0.5 mL），反复缓慢吹打，滤布过滤；将细胞以1.2×105/cm2的密度接种于多聚赖氨酸包被过的培养皿和孔板中，24 h后全换液，此后每3 d半换液培养。

1.2.2  OGD/R细胞模型制备及实验分组  神经元培养7 d后，以磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗２次，随机分为Sham组（A组）、OGD/R组（B组）、OGD/R+LW6组（C组）、OGD/R+低浓度Dex组（D组）、OGD/R+高浓度Dex组（E组）。Sham组加入有糖细胞外液，置于正常培养箱中培养；ODG/R组加入无糖细胞外液，置于37 ℃厌氧箱（内含体积分数0.95的N2和体积分数0.05的CO2）中低氧处理制备OGD/R细胞模型，1 h后将培养液换为无血清培养液；OGD/R+LW6组：OGD/R模型细胞加入1 mmol/L的LW6处理1 h，加入等体积无血清DMEM培养液；OGD/R+低浓度Dex组：OGD/R模型细胞加入0.1 μmol/L Dex处理1 h后，弃去原培养液，加入等体积的无血清DMEM培养液；OGD/R+高浓度Dex组：OGD/R模型细胞加入1.0 μmol/L Dex处理1 h后，弃去原培养液，加入等体积无血清DMEM培养液。

1.2.3  CCK-8比色法检测神经元的存活率  弃掉96孔板中的培养液，用PBS清洗细胞，每孔加入含体积分数0.10 CCK-8的细胞培养液，避光孵育4 h。使用酶标仪检测各孔波长450 nm处的吸光度，计算细胞存活率。

1.2.4  免疫荧光染色法检测神经元的生长状态

原代神经元接种于装有盖玻片的24孔培养板中培养7 d后，取出爬片，用PBS洗3次，每次5 min；每孔加入1 mL组织固定液固定20 min；再用PBS洗3次，每次10 min；以含体积分数0.002 5 Triton-100 溶液破膜10 min，以含体积分数0.05羊血清清蛋白封闭液封闭1 h，加入一抗MAP-2抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；然后加二抗山羊抗体IgG抗體（1∶1 000）室温避光孵育1 h。用含DAPI染料的抗荧光衰减封片剂进行封片后，荧光显微镜下采集图像，观察原代神经元的形态。

1.2.5  Western blot方法检测相关蛋白表达  参照相关文献［10］，应用Western blot方法检测皮质神经元内HIF-1α、ATF-6和CHOP蛋白表达水平，使用100 g/L SDS PAGE分析神经元样品。应用一抗（HIF-1α、ATF-6和CHOP 为1∶1 000，β-actin 1∶4 000）和相应二抗（1∶20 000）孵育膜，ECL 显影成像。应用Image J软件对数据进行量化。实验重复3次，取平均值。

1.3  统计学分析

使用Graph Pad Prism 8.0软件进行统计学分析。计量资料结果以±s表示，两组比较采用t检验；多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结  果

2.1  Dex处理对OGD/R损伤后神经元存活影响

CCK-8比色法检测显示，各组神经元存活率差异有显著性（F=63.46，P<0.05）；两两比较，B组细胞存活率较A组降低（P<0.05）， C组和E组的神经元存活率较B组显著提高（P<0.05）。见表1。免疫荧光染色观察显示，与Sham组相比，OGD/R处理组神经元数目明显减少；与OGD/R处理组相比，OGD/R+高浓度Dex处理组神经元数目明显增加，OGD/R+低浓度Dex处理组神经元数目没有变化。免疫荧光结果显示，加入高浓度Dex培养后神经元的存活数目增加（图1）。

2.2  各组HIF-1α、ATF-6和CHOP蛋白表达比较

Western blot结果显示，各组HIF-1α、ATF-6、CHOP蛋白表达差异有统计学意义（F=80.30～155.36，P<0.05）。两两比较显示，OGD/R处理组HIF-1α、ATF-6、CHOP蛋白表达水平均较Sham组升高，差异有统计学意义（P<0.05），OGD/R+高浓度Dex处理组HIF-1α、ATF-6、CHOP蛋白水平较OGD/R处理组降低（P<0.05）。见图2、表1。

3  讨  论

脑卒中是世界范围内死亡率高、致残率高的疾病，其发病后可能给家庭及社会带来沉重负担。本

研究通过大鼠神经元体外模拟脑缺血再灌注损伤，探讨Dex对神经损伤的保护作用及其可能的机制，从而为缺血性脑损伤治疗提供新的方向。

有研究表明，Dex通过抑制HIF-1α的表达发挥神经保护作用［11］。还有研究表明，神经元OGD/R损伤后HIF-1α蛋白表达水平显著提高［12-13］。因此本文检测了OGD/R损伤后的神经元内HIF-1α的表达。为了进一步确定HIF-1α的下游ATF-6、CHOP的蛋白变化，本文通过对OGD/R损伤后神经元模型给予Dex 1.0 μmol/L药物处理来观察HIF-1α下游通路ATF-6、CHOP的蛋白变化，结果表明，Dex促进了OGD/R损伤神经元的存活并且降低了损伤后原代神经元中HIF-1α、ATF-6和CHOP蛋白的表达，表明Dex在OGD/R损伤中通过调节HIF-1α的表达发挥神经保护作用。本文研究结果还显示，低浓度的Dex对OGD/R损伤神经元存活不具有保护作用，而高浓度的Dex提高了OGD/R损伤神经元的存活，发挥了保护作用。

HIF-1由HIF-1α和HIF-1β亞单位组成。每个亚单位都包含基本bHLH-PAS结构域，该结构域介导异源二聚和DNA结合。许多研究已经通过其转录活性确定了HIF-1α在细胞功能和功能障碍中的重要作用。

HIF-1α是具有转录活性的核蛋白，具有广泛的靶基因谱，通过对其下游靶基因的调控，在低氧适应、炎症发展及肿瘤生长等方面均起到重要的调节作用［14］。在OGD/R损伤下HIF-1α表达升高可导致细胞死亡［15］，抑制HIF-1α的表达则可能会减轻细胞低氧复氧损伤［16］。研究显示，LW6是HIF-1α的抑制剂［17］，其对神经元存活可起到保护作用。因此，本实验将OGD/R损伤+LW6组作为OGD/R的阳性药物对照组进行研究，结果显示LW6对正常培养的神经元存活率和HIF-1α蛋白表达没有明显影响，但高浓度Dex提高了OGD/R损伤神经元的存活率，也显著降低了HIF-1α表达。

DAPI：免疫荧光染色为蓝色，标记各组神经元的细胞核；Map2：一抗为羊抗兔，二抗为兔来源，免疫荧光染色为红色，标记各组神经元形态；Merge：将DAPI和Map2合并在一起，显示细胞存活率的变化。

ATF-6是HIF-1α的下游因子。已有研究结果显示，脑卒中后的小鼠内质网应激（ERs）显著增强［18］。越来越多的证据表明，ERs在神经元存活过程中起重要作用。在ERs状态下，ATF-6可易位至细胞核并诱导下游信号蛋白CHOP的表达［19］。研究表明，ERs在神经元存活过程中起重要作用［20］，ERs信号通路包括ATF-6、IRE1α和PERK通路。药物作用于ATF-6能够显著减轻细胞凋亡，降低凋亡相关的细胞因子如Caspase3、Caspase6等的表达［21］。CHOP是ERs反应共同下游信号分子，正常生理状态下其表达量低，在ERs状态下大量表达并促进细胞凋亡［22］。脑卒中后神经元可以通过CHOP发出信号并最终导致细胞凋亡发生。本研究结果显示，OGD/R损伤后神经元HIF-1α蛋白表达显著升高，LW6及高浓度Dex作用后HIF-1α、ATF-6及CHOP蛋白的表达水平显著降低，提示抑制HIF-1α的表达可能通过抑制ERs通路减轻OGD/R损伤的神经元凋亡，发挥神经保护作用。

综上所述，Dex对OGD/R损伤的神经元细胞具有保护作用，其机制可能通过下调HIF-1α蛋白表达抑制ATF-6、CHOP信号通路发挥神经保护作用。本文结果可以为开发有效的脑卒中治疗策略提供依据。但ATF-6如何通过下游信号通路发挥神经保护作用尚不清楚，有待后续进一步研究。

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（本文編辑  黄建乡）