马红球菌病的初步诊断和治疗

余万里 , 马玉辉 , 王彦峰 , 马思远 , 刘 璐 , 刘来珍 , 蔡 涛 , 赵红琼

(1.新疆农业大学动物医学学院 , 新疆 乌鲁木齐 830052 ; 2.新疆巴州动物疾病控制与诊断中心 , 新疆 巴州 841000 ; 3. 新疆昭苏县畜牧兽医发展中心 , 新疆 伊犁 835600 ; 4.新疆农业职业技术学院 , 新疆 昌吉 831100)

马红球菌病,又称马化脓性支气管肺炎,主要发生于1～6月龄马驹,呈全球范围分布[1-3]。该病发病率可达40%,死亡率高达80%,是引起马驹致病和死亡的重要因素之一,严重制约了马产业的发展,并造成巨大的经济损失[4]。该病病原马红球菌(Rhodococcusequi,R.equi)是一种常见的土壤腐生菌,马驹主要通过吸入尘土中的R.equi而感染[5]。R.equi不仅感染马,也可感染猪、牛和羊等其他动物,还能感染免疫功能低下的人[6-9]。产生胆固醇氧化酶(Cholesterol oxidase,ChoE)是R.equi的一个决定性特征,利用特定的引物和程序扩增choE基因可以鉴定是否为R.equi,扩增编码15～17 kDa毒力蛋白上的vapA基因可以鉴定致病性与非致病性R.equi[2]。本试验对4匹疑似感染马红球菌的马驹进行临床检查并采集肛拭子进行菌落PCR鉴定,以期为兽医临床马红球菌病的诊断和治疗提供参考。

1 病例情况

1.1 基本信息 2021年7月29日于新疆某马场接诊4匹患驹,均为2～4月龄英纯血马,体重分别为174.0、136.5、151.3和148.5 kg。

1.2 病史 4匹患驹在出生后2周内均有咳嗽症状,在2月龄左右出现较为严重的呼吸道疾病,通过青霉素和阿莫西林等抗生素治疗1个月均无效;病例1患驹在3月龄时,左后腿因为刮伤,形成一个外伤开放创,每天注射青霉素。

2 临床检查

4匹患驹均可见鼻孔处有黄色脓性鼻液,呼吸急促,有轻微咳嗽,触摸体表温度偏高,且病例4患驹伴有腹式呼吸。4匹患驹体温和呼吸频率均偏高,脉搏均在正常范围内(表1)。

表1 患驹临床检查结果

3 实验室检查

3.1 血常规和血清生化检查 用含EDTA-K2的抗凝管采集患驹颈静脉血,并用全自动血液细胞分析仪(Mindray,BC-5000VET)检测血常规指标。用非抗凝管采集患驹颈静脉血,分离血清,用全自动生化仪(Mindray,BS-240VET)检测血清生化指标。结果显示,4匹患驹白细胞(White blood cell,WBC)、中性粒细胞(Neutrophil,Neu)和淋巴细胞(Lymphocyte,Lym)数量均升高(表2),病例2、3和4患驹的红细胞(Red blood cell,RBC)数量均升高。病例1、3和4患驹的血糖(Glucose,GLU)、谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)和血清总蛋白(Total protein,TP)含量均下降;病例1和4患驹的白蛋白(Albumin,ALB)含量均下降;4匹患驹的血清肌酐(Creatinine,CREA)含量均下降(表3)。

表2 治疗前患驹血常规异常指标

表3 治疗前患驹血清生化异常指标

3.2 细菌分离和鉴别培养 患驹肛拭子置于脑心浸液琼脂培养液(Brain-heart infusion broth,BHI),后接种于NANAT(Nalidixic acid-novobiocin-actidione-potassium tellurite)鉴别培养基[5],30 ℃恒温培养48 h,观察生长菌落的形态并进行革兰染色。结果显示,在NANAT鉴别培养基上有形态呈灰黑色、黏稠样菌落(图1A);革兰染色结果为革兰阳性菌,在显微镜下观察到多数菌体呈两头钝圆的球杆状或棒状,仅有少数菌体呈卵圆形、球状、分枝形和栅栏样排列,菌体没有芽孢(图1B)。

图1 菌落形态鉴定

3.3R.equi的PCR鉴定 用细菌DNA提取试剂盒(全式金,EE61-01)提取NANAT鉴别培养基上生长的菌株的DNA进行PCR检测。参考菌株致病性R.equi103+(choE阳性,vapA阳性)为阳性对照,非致病性R.equi103-(choE阳性,vapA阴性)为阴性对照,均获赠于宁夏大学生命科学学院罗海霞教授。引物序列如表4所示,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR退火温度为55 ℃,30个循环。PCR扩增后,取反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像系统(Bio-Rad,ChemiDoc XRS+)上观察条带位置。结果显示,R.equi103+、R.equi103-和来自病例1～4 患驹的分离菌株均扩增出choEDNA片段,且大小符合预期960 bp;R.equi103+和病例1～4患驹的分离菌株扩均增出vapADNA片段,大小符合预期550 bp(图2),初步判断这4匹患驹均感染致病性R.equi。

图2 分离菌株的PCR鉴定

表4 vapA和choE的PCR引物序列

3.4 病例4患驹胸部B超检查 由于病例4患驹病情严重,使用B超对其第6肋间进行超声检查。结果显示,患驹肺部左侧有实质性阴影(图3)。

图3 病例4患驹胸部B超

4 诊断

4匹患驹均出现黄色脓性鼻液,呼吸急促、困难,体温升高,支气管和肺部听诊湿罗音,食欲减退等疑似马红球菌病临床症状,结合血常规、血清生化指标和PCR等实验室检测结果,初步诊断均为马红球菌病。

5 治疗和转归

5.1 治疗方法 口服利福平5 mg/(kg·bw)和一种大环内酯类药物,包括克拉霉素7.5 mg/(kg·bw)、阿奇霉素10 mg/(kg·bw)或红霉素25 mg/(kg·bw),2次/ d,连用5 d,休药3 d;之后再开启一个同样疗程,只是每匹患驹更换成与之前不同的一种大环内酯类药物,以期降低细菌耐药性。

5.2 转归 病例1和3患驹治疗1个月后,食欲、精神状态、呼吸、血常规和血清生化指标均恢复正常。病例2患驹治疗1个月后,食欲、精神状态、血常规和血清生化指标均恢复正常,但休药期阶段听诊仍有支气管音,患驹尚未完全恢复,需要继续接受治疗。病例4患驹在治疗过程中病情加重,在治疗第8天死亡。对病例4患驹剖检后用生理盐水冲洗肺部,抽取冲洗液进行细菌培养和PCR鉴定,结果为choE和vapA阳性,存在致病性R.equi。同时发现该患驹肺部有脓肿病变,与B超检查结果一致(图4)。用4%多聚甲醛固定患驹肺部组织,进行组织病理学检查发现,肺部毛细血管明显扩张充血,肺泡形态基本消失,部分组织细胞坏死,坏死细胞内出现大量细胞色素沉着(图5A),中性粒细胞浸润(图5B)。

图4 病例4患驹肺部解剖图

图5 病例4患驹肺部病理学检查(H.E.染色)

6 讨论

幼龄马驹由于免疫系统发育尚未成熟,因此极易受到外界各种病原侵害,尤其是呼吸系统。马驹易患的呼吸系统疾病主要是肺炎,常见的细菌性病原有R.equi和兽疫链球菌,革兰阴性菌在呼吸道疾病中也常见[10-11]。本试验中4例患驹的临床表现均以呼吸道症状为主,与其他研究中马红球菌病的临床症状具有一致性。

R.equi广泛存在于土壤和空气环境中,可通过呼吸道传播,通常马驹在出生后1周内易感染该菌,但不会表现出临床症状,待马驹成长到2月龄后,如若马驹感染的R.equi带有vapA毒力基因,则会迅速致病[12]。该病常见于2～6月龄的马驹,但也有报道显示最早可影响1月龄的马驹[10]。该病呈急性暴发,患驹表现为精神沉郁、嗜睡和食欲减退等[13],主要临床表现为急性发热、呼吸困难、咳嗽和鼻腔有脓性分泌物等;血液学检查可见患驹白细胞、淋巴细胞和嗜中性粒细胞严重增多[14]。感染R.equi后,患驹上呼吸道和肺部形成脓肿,肺实质区域内形成结节灶,可以通过超声和内窥镜等检查观察到脓肿情况。肺部严重感染的患驹,可能会造成呼吸衰竭,如果该菌蔓延至身体其他部位,如腹腔、关节或骨髓,则会造成预后不良[15]。

白丽鸽等和Giguere等研究表明,目前尚无更好治疗马红球菌病的特效药,依旧建议使用红霉素、克拉霉素或阿奇霉素与利福平联合用药治疗马红球菌病[11,16]。但长期使用大环内酯类亲脂类抗生素治疗马红球菌感染会导致R.equi产生耐药性。因此,本试验在治疗马红球菌病时考虑到长时间使用同一种药或两种以上的药物会导致R.equi产生耐药性,从而选择交替用药。大环内酯类药物可引起成年马匹肠道菌群的紊乱,更严重会造成成年马患结肠炎。马驹出现发热症状可配合使用非甾体类抗炎药,当患驹肺部严重感染影响呼吸时应及时吸氧,同时配合使用气管扩张剂。因此当马驹感染R.equi后,需将其隔离,以防其他马匹通过接触粪便感染。研究表明,利福平和大环内酯类药物联合用药,会引起17%～36%患驹腹泻,一般腹泻会自愈,不影响给药治疗,若患驹发生严重腹泻导致脱水和电解质紊乱,需要停止给药,更改治疗方案[16-21]。应注意的是,患驹在给药治疗的前5 d,给药时间应间隔至少1 h,以提高大环内酯类药物的吸收率。

Muscatello等研究发现,酸性的土壤可能是导致致病性R.equi含量上升的因素[3],Hughes等研究发现,马粪中的简单有机酸对R.equi的生长具有促进作用,因此在含有马粪的土壤中更有利于R.equi的繁殖[22]。本试验中病例3患驹在2月龄前体征正常,病例2患驹在3月龄前出现轻微咳嗽,有严重的支气管音等症状,疑似感染马红球菌。当时由于圈舍紧张的原因,2匹患驹饲养在同一个马厩,1周后病例3患驹出现同样症状,推测病例3患驹通过接触病例2患驹导致其感染,但具体发病机制有待进一步研究。食物的摄取对机体营养状态和健康水平有着直接影响,刘海港等研究发现,在动物生命过程中,日粮营养在抵抗各种应激和疾病免疫机能方面发挥重要作用[23]。潘晓花等研究发现,营养物质和能量代谢是维持免疫细胞活性和功能的重要基础[24]。在本试验中,通过血清生化检测发现患驹处于营养不良状态,因此抵抗病原的能力有所下降。

本试验病例2患驹在治疗过程中病情出现好转,但是停止用药后,又出现呼吸急促症状,听诊肺部有支气管音,考虑到可能是R.equi与其他病原菌的混合感染或者治疗并未完全清除R.equi,应根据实际情况再对症治疗。

R.equi广泛存在于土壤环境和空气中,可以通过呼吸道传播[5]。因此,建议加强马圈舍的饲养管理,增加马厩清理和消毒频次;保持圈舍内通风;对初步诊断为马红球菌病的患驹应单独隔离,避免出现交叉感染,危害到健康马匹;增加幼驹营养,以提高自身免疫水平,使幼驹处于免疫机能最佳的状态。