环境中病毒的生存与传播及其研究技术

宫冉冉 , 胡 涛 , 田文骏 , 宋世豪 , 王晓佳,2

(1.中国农业大学动物医学院 , 北京 海淀 100193 ; 2.中国农业大学动物医学院 兽医公共卫生安全全国重点实验室 , 北京 海淀 100193)

病毒的复制、转录和翻译过程都在宿主细胞中进行,其可利用细胞中的物质和能量完成生命活动,并产生新一代病毒。病毒离开宿主不能自我复制,长期以来环境中的病毒并未引起科学界的广泛关注,因此科研人员也没有做好系统的知识积累和技术防控准备,导致面对复杂多变且快速传播的新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)时,无法及时准确地提供建议、对策和措施。因此,各个领域的科研人员展开深刻思考,并围绕环境中病毒生存和传播等方向进行了跨学科交叉合作研究,本文对研究历程和进展综述如下。

1 病毒在环境中的状态与致病性

1.1 病毒聚集 一直以来,病毒被认为是没有自我意识的蛋白质和核酸,其生命活动也被简单定义为细胞内无自主意识的复制和翻译。只有很少一部分人关注病毒在环境中的状态和行为,及其社会性。病毒在体外环境中可以相互识别,并通过表面糖蛋白结合在一起,形成一个具有感染力的组织团体,它们可以在对方的帮助下更好地入侵细胞,从而保存自己的遗传物质,保障自身的繁衍生存[1]。

环境中病毒遇到体外消毒剂时,会自发聚集在一起,处于病毒团外层的病毒粒子会保护内部的病毒粒子不被破坏。在肠道病毒感染者的粪便样本中,80%的病毒聚集存在,甚至一些聚集体被包裹在细胞碎片中,从而可以在严苛的环境中存活[1]。在抗病毒反应强烈的细胞中,病毒聚集可导致多个病毒基因组共存于同一感染单元内,因此被感染的细胞能够释放更多的子代病毒体[2]。体内病毒聚集受宿主生物特性的影响,例如,水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)在唾液中呈纤维蛋白原γ链剂量依赖性聚集,但不排除其他蛋白质或细胞因子的参与[3]。体外环境中有许多物理或化学因素可诱导病毒聚集体的产生,例如,鼠肝炎病毒A59毒株对pH敏感性较强,当环境温度稳定在37 ℃时,该病毒在pH 6.0环境中稳定存在,半衰期为24 h;但在pH 8.0环境中,病毒尖峰糖蛋白构象发生改变,病毒迅速且不可逆地失活,半衰期为30 min,同时病毒形成团块和大聚集体[4]。另外,如表1所示,改变水体条件能够诱导水中病毒的聚集,在pH为7.0时,脊髓灰质炎病毒和呼肠孤病毒均未聚集或混合聚集,在降低水体离子强度后,脊髓灰质炎病毒聚集,但呼肠孤病毒仍未聚集,两种病毒也未形成混合聚集体;在pH为6.0时,脊髓灰质炎病毒再次聚集,尽管呼肠孤病毒未聚集,但它附着在脊髓灰质炎病毒聚集物上;在pH为5.0及以下时,两种病毒大量聚集并形成大的混合聚集体[5]。

表1 脊髓灰质炎病毒和呼肠孤病毒在不同pH和离子强度下的聚集情况

1.2 病毒颗粒形态 病毒聚集体成功入侵宿主细胞后,能够释放多个病毒基因组,这些多基因组结构能够促进病毒-病毒相互作用,或加速病毒社会样特征的进化,更有可能进行胞内重组导致不寻常毒株出现[6]。甲型流感病毒粒子具多形性,常表现为球形、丝状等,从甲流患者体内分离出来的病毒毒株常呈丝状,经多次传代培养后,子代病毒表现为典型的球形,并伴随毒力减弱[7]。有些RNA病毒会将每一段基因组都包装成单独颗粒,单独颗粒侵入宿主细胞不会指示子代病毒的产生,病毒若想顺利繁殖下去并完成生产性感染,必须抱团共同感染入侵宿主细胞,感染成功的概率也因此提高[8]。

2 病毒的生存规律和传播模式

2.1 病毒生存规律 病毒在环境中没有自养能力,需要了解其在环境中的生存规律,以研究病毒传播的可能模式。大气温度和相对湿度(Relative humidity,RH)等因素对环境病原体的生存与传播有重要影响,SARS-CoV-2和流感病毒的相关研究均发现,与低RH或高RH相比,病毒在中等RH环境下更容易被灭活[9]。温湿度、酸碱度和环境共存物等都会影响病毒在环境中存活的持久性。微塑料是近年来新出现的一种颗粒样污染物,在空气和水中都可被检出[10]。据报道,病毒能够吸附于微塑料表面以增加其生存、感染和传播的可能性[10]。除微塑料外,不锈钢、河水和土壤等非生命环境也都能够成为病毒生存的载体,且病毒粒子的完整性可得到有效维持[11]。

流感病毒常通过飞沫传播,有研究使用包膜噬菌体Phi6作为流感病毒的替代物,发现Phi6在飞沫中的存活率与环境的RH密切相关[12]。此外,Scanlan等创建了亨德拉病毒(Hendra virus,HeV)的环境生存模型,并发现HeV在低温和高纬度区域存活率更高[13]。研究污染物上含病毒唾液飞沫的结构和蒸发动态及其对病毒活力的影响,有助于认清病毒的生存规律。本课题组研究发现,唾液中的某些物质可以对病毒起直接作用,在液滴残留的“咖啡环”区域内,抗病毒蛋白和病毒粒子的直接接触导致病毒活力与RH之间存在一个U-型关系;随着液滴干燥,盐类分子并没有在咖啡环中与病毒直接接触,其中残留的抗病毒蛋白是影响U-型关系的重要因素(图1);在液滴蒸发和干燥过程中,病毒粒子和咖啡环中抗病毒蛋白的直接接触可能有助于U-型关系的建立;在中等RH时,抗病毒蛋白对咖啡环内病毒粒子的影响最明显[14]。由于蒸发诱导对流引起的流动运动,抗病毒蛋白和病毒粒子被夹带、聚集和积累在咖啡环中,小颗粒分布在咖啡环的外层,大颗粒分布在咖啡环的内部,盐晶体在液滴残渣的中心形成[14]。病毒和消毒剂的有效成分存在空间分布的差异,这可能是现有一些消毒剂需要加大使用浓度的原因。

图1 含病毒唾液液滴的蒸发演化示意图

2.2 病毒传播模式 SARS-CoV-2具有很强的传播能力,能通过与易感者接触或者经呼吸道感染,并无规律可循。病毒可以在多种因素诱导下形成聚集体或者在同一囊泡中出芽,Andreu-Moreno等证实VSV聚集体的适应能力和生产性感染能力都比VSV独居体更强[2]。病毒传播常由携带病毒基因组的结构(如脂质囊泡)介导,这些结构增加了感染的多样性[8]。不同类型的集体感染单位能够导致多个病毒基因组共同传递到目标细胞,从而有利于共同感染[15]。

环境是影响病毒传播的关键因素,流感病毒是一类典型的气溶胶传播病毒,存在明显的季节性[9]。在受控环境中,相对湿度和温度是影响流感病毒传播的主要因素[9]。然而,对于环境流感病毒的生存和传播,绝对湿度具有比相对湿度更高的影响力[16]。恶劣的天气环境(如沙尘暴)对病毒传播造成的影响更大,风载病毒可借风从起源地被运输数千米,当空气中沙尘含量大时,病毒甚至可被传播到数万米外的地方[17]。

2.3 外泌体 外泌体(Exosomes,EVs)是一种直径≤100 nm的细胞分泌物,源于溶酶体内陷所形成的多囊体(Multivesicularbody,MVB),如图2所示,MVB与细胞膜融合后,EVs以胞吐形式释放[18]。EVs性质稳定,在细胞间通信中至关重要,可作为蛋白质和核酸的载体及生物循环过程中的标志物,用来诊断疾病[18]。在病毒包装出芽阶段,EVs包裹病毒,逃避免疫应答,提高子代病毒的存活率,并增加感染细胞的多样性,但其可能会导致突变叠加积累[18-19]。在无包膜病毒中,甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)从细胞释放后能够隐藏在源自宿主的膜中,通过类似EVs形式感染宿主[20]。许多病毒颗粒聚集在EVs中可提高病毒的基因重组概率,提高整个病毒种群的适应性,基因组分节段的病毒可重排形成新基因型病毒(图2)[21]。也有许多肠病毒颗粒被包装在EVs中,而后从细胞中非溶解性释放,与游离单病毒颗粒相比感染效率更高[22]。

图2 细胞外囊泡介导细胞间非裂解病毒集体传播示意图

3 环境病毒学研究技术

3.1 病原体检测技术 新型冠状病毒肺炎(Corona virus disease 2019,COVID-19)期间,核酸检测技术是金标准,SARS-CoV-2核酸检测原理是逆转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),该方法灵敏度和准确率高,但开展实验需要专业的实验室、实验仪器和操作人员,并且检测需用时几小时[23]。随着病例数量的增长,实验室的检测工作量加大,总体检测时长会相应增加,因此限制了该方法的使用。

即时检测(Point-of-care testing,POCT)能够在任何时间、任何地点自由开展,与传统实验室检测相比,POCT在样本处理、仪器使用和操作人员要求方面都有了极大的进步。2012年,Trantum等报道了一种基于咖啡环效应(Coffee-ring effect,CRE)进行疟疾检测的技术模型,检测结果最终以红、绿、黄3种颜色信号方式呈现[24]。POCT的关键是能够进行微量检测,刘宏团队研发了一种环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与CRE结合的可视化定量检测微量核酸的技术,该技术突破浊度法局限,将反应后的溶液滴加在胶体晶体基板上,副产物(焦磷酸镁)沉积形成咖啡环,样品中病原体含量的高低与咖啡环的宽度存在比例关系[25]。CRE与基于毛细管辅助装置的生物传感器结合,能够对样品进行有效预浓缩,显著提高检测装置对目标病毒的敏感性[26]。COVID-19的流行加速了病原体快速检测新技术的问世。Samper等研发出一种新型电化学毛细管流动装置,该装置对SARS-CoV-2 N蛋白的IgG抗体敏感,可达到市场检测标准,且成本较低,有望成为医疗点的常用检测技术[27]。SARS-CoV-2能够随生活污水进入排水管道,进而通过飞溅出的水滴进入居民家并造成传播扩散。Mao等提出了一种利用纸张现场检测废水中SARS-CoV-2的技术,能够快速检测出废水中的病原体,且具有便携和易处理的特点,为疫病的预防和控制提供参考资料[28]。在无法承建专业实验室的地区,POCT检测以其简单、便携的特点,广泛用于环境病毒的监测和预警。

3.2 病毒消杀剂 许多病毒可通过气溶胶传播,降雨能够直接沉降上层大气中的病毒[29]。Whon等报道了3处不同地点的近地空气样本中病毒的空间丰度,结果介于1.7×106～4.0×107/m3,无显著差异,同时雨水中检出的病毒与居民区检出的病毒具有相似性[29]。人类大部分时间是在相对封闭的室内度过,与外界的气体交换主要靠开窗或空调通风系统,作为密闭环境,室内类似一个大的微生物培养罐。Prussin等对9处室内环境的病毒丰度进行了检测,结果显示,每立方米空间病毒丰度高达(5.9±3.9)×105;同时,9处室内环境的病毒丰度均明显高于室外环境[30]。针对空气、水、室内等环境进行病原体消毒,需要选择合适的消毒剂和消杀模式。人们的消毒观念往往认为消毒剂用量越大、活性越高,更有利于杀灭病毒;事实相反,消毒剂中有机物质的存在可能会使病毒聚集体更难分散,使病毒对消毒剂更具抵抗力,因此活性较低的消毒剂才能够更好地消灭聚集物中的病毒[1]。此外,由于采样检测数据并不能真实反映整体环境的病毒存在情况,或许会导致消杀结果与预期产生偏差,需要格外留意。

3.3 新技术及其应用潜力

3.3.1 外泌体相似研究技术 在物理和分子特性上,SARS-CoV-2病毒粒子与EVs具有相似性,因此EVs的分离和检测技术也可能适用于病毒[31]。病毒粒子可以聚集在囊泡内向邻近细胞传播,产生细胞间病毒共感染,细菌的存在可能会促进这种共感染现象的发生[32]。大多数巨型病毒需经阿米巴吞噬才能入侵细胞,触发阿米巴吞噬的首要条件是巨型病毒颗粒大小达500 nm,但直径仅有250 nm的马赛病毒(Marseillevirus,MsV)也能触发这一途径[33]。Arantes等报道,MsV能够形成大型囊泡,其中含有多个病毒粒子,可刺激阿米巴吞噬发生,暴露于70 ℃中7～10 min的巨型囊泡仍具感染力,而单个病毒粒子失去感染力[33]。被包裹在囊泡中的病毒还可以逃避宿主免疫应答。肠道病毒传播主要依靠粪-口途径,粪便中的病毒载量和感染力是病毒传播力的关键参数。单分散病毒粒子曾被认为具有最佳感染力,但是进一步研究发现,囊泡内病毒聚集体产生的病毒数量更多[22]。这也表明,粪便囊泡中的“病毒簇”可提高感染成功率,克服复制障碍[32]。这些发现有助于病毒检测新技术的开发。

3.3.2 流式细胞术 在对病毒聚集的分析中,流式细胞术检测结果显示,病毒粒子处于低pH环境时更易聚集,并可增加病毒共感染的概率[8]。以流式细胞术为原理的病毒分析被称为流式病毒测定法(Flow virometry,FVM)[34]。FVM能够用来测定病毒粒子的物理特征和目标病毒丰度,测量病毒颗粒的大小,但因流式细胞仪对目标物颗粒尺寸的限制,该方法在技术层面仍存在不少缺陷[35]。

3.3.3 宏基因组技术 宏基因组被定义为自然界中发现的全部微生物群的基因组,该技术以基因文库为支撑。Breitbart等通过建立海洋中已知病毒的宏基因组文库成功分析并发现了多种未知病毒,为了解海洋病毒多样性、天然药物研发和海洋病毒群落探索等提供资料[36]。Whon等采用宏基因组方法对某地区近地空气中的单链DNA病毒进行分析,显示出近半数的未知序列,表明空气中可能存在某些未知的病毒[29]。宏基因组技术灵敏度高、准确性强,在发现新基因型病毒和预警新疾病流行中的应用前景可观;但基因组文库未完全覆盖所有生物的现状,对该技术的发展有所限制。

4 小结与展望

各种病毒性传染病的突发或者持续发生,少不了“病毒传播”这个关键环节,环境病毒的检测为了解病毒传播途径和追溯研究提供了重要证据,也成为预防和控制感染范围扩大的有效手段。COVID-19的肆虐,凸显出对病毒本“毒”的不了解,深入探究病毒粒子形态、结构动态变化及环境因素对病毒入侵和致病的影响,结合大数据分析预测、建立智能数据库,通过跨学科交叉合作,有利于建立病毒感染的共同认知和研究新范式。