生地百合西洋参胶囊对小鼠睡眠的促进作用及其安全性研究

赵雨杰 , 傅容湛 , 郭佳琦 , 朱晨辉

(1. 西北大学化工学院 西北大学生物医药研究院 , 陕西 西安 710069 ; 2. 陕西省医疗器械质量检验院 , 陕西 咸阳 712046)

据统计,成年人中慢性失眠患者占10%～15%,偶尔失眠的人占25%～35%[1]。老年人和妇女是失眠的主要人群,除了原发性失眠症,共病性睡眠障碍也较常见,失眠不仅会影响日常工作,更会影响人体的健康,导致其他疾病的产生[2-3]。目前,治疗失眠的药物主要是化学合成的镇静类药物,这些药物不仅副作用大,长期服用还会产生药物依赖[4-5]。

中医治疗失眠历史悠久,组方百合地黄汤的应用也较为广泛,百合地黄汤最早记载于《金匮要略》[6],由7枚百合和1 L生地黄汁组成,适用于由心肺阴虚血燥、百脉失和导致的疾病,如不寐和郁症等。目前,百合地黄汤被广泛用于治疗多种疾病,如抑郁症、焦虑症、围绝经期综合征和失眠症等,且其在治疗失眠和安神方面具有良好的功效[7-9]。百合具有养阴润肺、清心安神的功效,适用于虚烦惊悸、失眠多梦和精神恍惚等症状[10]。百合中所含的百合皂苷具有镇静催眠的作用,能缩短入睡时间,提高睡眠质量[11]; 其中的百合多糖和百合皂苷还具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖和免疫调节的作用[12]。生地黄具有清热凉血、养阴生津的功效,可清心火、滋肾阴[13]。生地黄中所含的苷类、氨基酸类、糖类和有机酸类物质具有抗肿瘤、降血糖、抗衰老和降血糖的功效[14]。西洋参具有补气养阴、清热生津的功效,其所含的人参皂苷具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、镇静和神经保护等作用[15]。

生地百合西洋参胶囊是由百合提取物、生地黄提取物和西洋参提取物为原料制备而成的,本试验根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)[16]对其改善睡眠的功能进行评价,并通过小鼠急性毒性试验和大鼠30 d喂养试验判定其安全性。

1 材料与方法

1.1 试验样品与主要试剂 生地百合西洋参胶囊(其中原料生地黄提取物、百合提取物和西洋参提取物均为水提物,且其提取率分别为20%、10%和16%),规格为0.4 g/粒(每粒含生地黄提取物0.23 g、百合提取物0.08 g、西洋参提取物0.07 g,其余为淀粉和硬脂酸镁),由某生物公司提供;戊巴比妥钠(纯度>99%),购自美国Sigma公司;小鼠5羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)和多巴胺(Dopamine,DA)酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒,均购自南京建成生物工程有限公司。

1.2 实验动物 SPF级昆明小鼠,雄性130只,雌性10只,体重为18～22 g,购于西安交通大学医学部实验动物中心[生产许可证号:SCXK(陕)2018—001];80只SD大鼠,雌雄各半,体重为80～100 g,购于中国人民解放军第四军医大学实验动物中心[生产许可证号:SCXK(陕)2019—001]。

1.3 主要仪器 RS-7010秒表(深圳市锐赛科技有限公司);电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司];HC海迈血液测试系统(山东美医林电子仪器有限公司);全自动生化分析仪(博士泰生物科技有限公司);TGL-20台式高速离心机(山东百欧医疗科技有限公司);酶标仪(BioTek 伯腾公司)。

1.4 小鼠睡眠试验

1.4.1 剂量选择[17]生地百合西洋参胶囊的成人推荐服用量为2 次/d,3粒/次(相当于每天服用生药量百合5 g、生地黄7 g、西洋参2.5 g),按成人体重为60 kg计算,使用剂量为40 mg/(kg·bw),根据人体推荐剂量的5、10和20倍计算小鼠生地百合西洋参胶囊低、中、高剂量组给药剂量分别为每天200、400和800 mg/(kg·bw),对照组给予等量蒸馏水,每组30只雄性小鼠,连续灌胃给药30 d。

1.4.2 直接诱导睡眠试验 将小鼠置于背卧位时,其能立即翻正身位。末次给药结束后,每组随机选取10只小鼠,以翻正反射消失为睡眠指标,如果超过50 s不能翻正则认为翻正反射消失,小鼠进入睡眠;翻正反射恢复即为小鼠觉醒,翻正反射消失至恢复的这段时间为睡眠时间,记录各组小鼠入睡只数和睡眠时间。

1.4.3 延长戊巴比妥钠睡眠时间试验 预试验确定戊巴比妥钠的使用剂量为45 mg/(kg·bw),将1.4.2中各组小鼠在末次给药30 min后腹腔注射戊巴比妥钠溶液,记录各组小鼠在给予戊巴比妥钠后的睡眠时间。

1.4.4 戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验 预试验确定戊巴比妥钠阈下剂量为25 mg/(kg·bw),从1.4.1中各组各随机选取10只小鼠,末次给药20 min后腹腔注射戊巴比妥钠阈下剂量,记录各组小鼠在给予戊巴比妥钠30 min后的入睡只数。

1.4.5 小鼠脑组织中神经递质含量的测定 从1.4.1中各组各随机选取10只小鼠,在末次灌胃后处死小鼠,立即取出其脑组织,用生理盐水清洗后,按照ELISA试剂盒说明书操作分别测定小鼠脑组织中5-HT、GABA和DA的含量。

1.5 小鼠急性毒性试验 随机选取20只小鼠(雌雄各半),采用最大给药剂量试验法(Maximum tolerated dose,MTD),按照15 g/(kg·bw)剂量对小鼠进行灌胃给药,2 次/d,2次灌胃间隔时间为4 h,连续灌胃14 d,分别在第0、7、14天称量小鼠体重,观察并记录小鼠死亡情况。

1.6 大鼠30 d喂养试验 将80只SD大鼠随机分为4个组,每组20只。生地百合西洋参胶囊低[1 g/(kg·bw)]、中[2 g/(kg·bw)]和高[4 g/(kg·bw)]剂量组的给药剂量相当于人体推荐剂量的25、50和100倍,对照组给予等量蒸馏水。连续灌胃给药30 d。每天观察大鼠的日常活动情况,记录体重和进食量,计算食物利用率。试验结束后处死大鼠,检测其血常规指标,称量并记录肝脏、肾脏和脾脏的重量,计算脏器系数。

1.7 统计分析 试验结果以“平均值±标准差(Mean±SD)”方式表示。采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 生地百合西洋参胶囊的直接睡眠作用 给予小鼠不同剂量生地百合西洋参胶囊30 d后,小鼠均未出现翻正反射消失的现象,表明生地百合西洋参胶囊对小鼠没有直接诱导睡眠的作用。

2.2 生地百合西洋参胶囊对戊巴比妥钠睡眠时间的影响 如表1所示,与对照组相比,生地百合西洋参胶囊高、中、低剂量组小鼠的戊巴比妥钠睡眠时间分别延长55.29%、46.29%和23.26%,差异均具有显著性(P<0.05或P<0.01),且随着生地百合西洋参胶囊剂量的增加,戊巴比妥钠睡眠时间的延长率也随之增加,表明生地百合西洋参胶囊能延长戊巴比妥钠睡眠时间。

表1 生地百合西洋参胶囊对戊巴比妥钠睡眠时间的影响

2.3 生地百合西洋参胶囊对戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用的影响 如表2所示,与对照组相比,生地百合西洋参胶囊各剂量组小鼠的催眠入睡率均有所提高,其中,中、高剂量组与对照组的差异均具有显著性(P<0.05或P<0.01),表明生地百合西洋参胶囊可以提高戊巴比妥钠阈下剂量小鼠的入睡率。

表2 生地百合西洋参胶囊对戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用的影响

2.4 生地百合西洋参胶囊对小鼠脑组织中5-HT、GABA和DA含量的影响 如表3所示,与对照组相比,生地百合西洋参胶囊各剂量组小鼠脑组织中5-HT含量增高,其中,中、高剂量组与对照组的差异均具有显著性(P<0.05);生地百合西洋参胶囊各剂量组GABA含量均升高,其中,中、高剂量组与对照组的差异均具有显著性(P<0.05或P<0.01);生地百合西洋参胶囊各剂量组DA含量均有所降低,其中高剂量组与对照组的差异具有显著性(P<0.05)。

表3 生地百合西洋参胶囊对小鼠脑组织中5-HT、GABA和DA含量的影响

2.5 生地百合西洋参胶囊小鼠急性毒性试验 如表4所示,生地百合西洋参胶囊连续灌胃14 d,小鼠均未出现死亡和中毒现象,表明生地百合西洋参胶囊对小鼠的急性经口最大耐受剂量大于15 g/(kg·bw),属无毒级。

表4 生地百合西洋参胶囊小鼠急性毒性试验结果

2.6 生地百合西洋参胶囊大鼠30 d喂养试验 在连续30 d灌胃不同剂量生地百合西洋参胶囊期间,大鼠均无不良反应,生长发育正常。喂养30 d后,与对照组相比,各剂量组大鼠体重增长量、进食量、食物利用率、血常规指标、血液生化指标和脏器系数均无显著性差异(P>0.05),表明生地百合西洋参胶囊安全性良好。

3 讨论

中医理论认为不寐即失眠,主要是由脏腑失和及体内阴阳失衡导致心神不安的疾病所致[18]。阴虚火旺是失眠常见的原因之一,随着社会压力的增大,熬夜时有发生,长期熬夜、压力倍增和情志太过都会耗伤阴液,导致阴虚火旺、神乱不寐[19]。张忠等[20]使用百合地黄汤,以百合和地黄为主药进行加减,治疗由阴虚火旺所致的失眠症,结果显示,患者阴复热退、神安而寐,临床有效率达93.75%。《金匮要略》[6]中记载的百合地黄汤能有效治疗精神和饮食导致的睡眠失调,目前多通过百合地黄联用其他方法治疗失眠。利顺欣[21]利用百合地黄汤合酸枣仁汤加味治疗老年失眠,总有效率达94.4%。褚雪菲等[22]采用四逆散合百合地黄汤加减方治疗焦虑性失眠,证明其具有疏肝解郁、清心安神的作用,可改善患者的睡眠和焦虑状态。张慧等[23]将百合地黄汤和镇静安神针法联合使用治疗女性围绝经期失眠,结果发现,该方法能提高患者的睡眠质量,且不易产生药物依赖,无不良反应,同样说明了百合和地黄具有改善睡眠的功效。

单胺类神经递质包括5-HT和DA,与失眠、焦虑和抑郁等密切相关[24]。研究发现,5-HT含量的增加可以改善失眠症状[25]。张萍等[26]研究表明,百合地黄汤发挥作用是通过调节脑内单胺类神经递质的表达,百合地黄汤能显著提高大鼠大脑中5-HT的含量,与本试验中生地百合西洋参胶囊各剂量组小鼠脑组织中5-HT的含量均有所增高的结果一致。DA对人体情绪和睡眠的调节有重要作用,DA含量过多或过少都会导致睡眠问题的发生[27]。本试验中生地百合西洋参胶囊各剂量组小鼠脑组织中的DA含量均有所降低,与郑竹宏等[28]关于百合地黄汤对失眠模型大鼠脑组织中DA的影响结果一致。GABA是脑内重要的神经递质,对神经元的兴奋程度有重要的影响,是神经系统中的神经抑制剂[29]。研究发现,失眠患者中枢神经中的GABA含量显著降低[30]。本试验中生地百合西洋参胶囊各剂量组的GABA含量均不同程度的升高。康心茹等[31]研究也显示,百合提取物可有效增加小鼠脑组织中GABA含量,与本试验结果一致。这些研究均表明,百合地黄西洋参胶囊改善睡眠可能是通过调节脑组织中5-HT、DA和GABA的含量。

百合具有清心安神的功效,其作用机制可能与促进单胺类神经递质以及抑制其氧化酶活性相关,可以改善失眠症状[32]。Wang等[33]研究发现,百合的镇静催眠作用可能与百合中所含的总皂苷和薯蓣皂苷有关。郭秋平等[34]研究也证明,百合皂苷对大鼠脑内DA和5-HT的紊乱具有改善作用。研究显示,生地黄中的烯醚萜类和黄酮类等化合物能调节神经递质,适用于各种原因导致的失眠[35-36]。西洋参具有滋补、养阴和安神的功效,其所含的多种人参皂苷能发挥多种生物学功能,其中,人参皂苷Rb1具有改善睡眠的作用[37]。西洋参中的主要有效成分人参皂苷可以调节中枢神经系统和外周神经系统,总皂苷能抑制中枢神经以达到镇静的作用[38]。本试验中的生地百合西洋参胶囊在百合和生地黄的基础上添加西洋参,不仅能达到镇静、安神的作用,还能达到治疗阴虚内热、补气养阴的功效。

本试验根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)[16]中的改善睡眠功能评价方法,通过给小鼠灌服不同剂量生地百合西洋参胶囊进行直接诱导睡眠试验、延长戊巴比妥钠睡眠时间试验和戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验,证明了生地百合西洋参胶囊具有改善睡眠的作用。进一步对小鼠脑组织中5-HT、GABA和DA含量进行检测,发现该胶囊改善小鼠睡眠作用的机制可能是通过调节小鼠脑组织内神经递质(5-HT、GABA和DA)的含量。最后通过小鼠急性毒性试验和大鼠30 d喂养试验,证实生地百合西洋参胶囊对小鼠无急性毒性,对大鼠无毒副作用,说明该产品在本试验剂量范围内无毒性。本试验为生地百合西洋胶囊在保健食品和功能食品中的应用提供了参考,但关于百合、地黄和西洋参各自改善睡眠的作用机制尚不清楚,还需进一步研究。