乙醇C、O、H稳定同位素在白酒掺伪鉴别中的潜在差异分析

杨华瑞，严虞虞，彭祖茂，李 意，陈伟杰，李明新，何诗慧，张协光

(1.深圳市计量质量检测研究院，广东深圳 518131；2.国家营养食品质量检验检测中心（广东），广东深圳 218131；3.贵州省产品质量检验检测院，贵州贵阳 550016)

白酒（Baijiu）是中国特有的一种蒸馏酒，与白兰地(Brandy)、威士忌(Whisky)、伏特加(Vodka)、朗姆酒(Rum)和金酒(Gin)一起并称为世界六大蒸馏酒。白酒是中国特色文化的象征之一，在中国数千年的历史中有着举足轻重的地位，古人借酒吟诗，流传出了“兰陵美酒郁金香，玉碗盛来琥珀光”“悲欢聚散一杯酒，南北东西万里程”“金樽清酒斗十千，玉盘珍羞直万钱”等诸多美好的诗词，而现代人们的餐饮文化中，白酒也是不可或缺的一个。白酒具有以酯类为主体的复合香味，与生产原料、酒曲、发酵工艺等有关，按香型可分为浓香型、酱香型、清香型等多种，其中浓香型白酒是产量最大的类型，具有窖香浓郁、入口醇甜、爽净、回味悠长的口感。

我国白酒消费市场巨大，部分知名品牌白酒价格高企，一些不法商贩在利益驱使下，利用低廉的工业酒精和食用酒精冒充品牌白酒进行售卖。白酒假冒伪劣事件层出不穷，严重影响了白酒市场的健康发展，而造成假冒白酒现象严重的主要原因之一是白酒鉴别缺乏科学的检测手段。白酒质量评价主要依靠品酒师对酒的感官评价，缺乏客观的评价标准及模型，主要是以酒的饮用和饮后口感对酒的品质进行初级判断，导致消费者无法准确客观的判断酒的品质和优劣。白酒的科学指标只有如总酸、总酯、高级醇、非酒精挥发物等少数几种常规指标，这些都不能有效的鉴别白酒的真伪，造成了监管无据可依的局面。

稳定同位素比质谱（Isotope Ratio Mass Spectrometry，IRMS）技术可通过测试样品中稳定同位素比值分辨样品的真伪、产地等，是国内外公认最有效的鉴别手段之一[1-2]。国外研究团队采用稳定同位素比质谱技术建立了葡萄酒、白兰地、朗姆酒等蒸馏酒的产地溯源和真伪鉴别方法[3-7]；国内利用稳定同位素比质谱技术在白酒稳定同位素比检测、酿造过程中稳定同位素变化、鉴别等方面也开展了诸多工作，如白酒中乙醇δ13C 值分析[8]、白酒中风味物质碳、氧稳定同位素分析[9-10]、白酒酿造过程中乙醇碳稳定同位素比值的变化[11]等。气相色谱-稳定同位素比质谱（GC-IRMS）在分析醇、酯等低沸点物质方面具有诸多优势，国内外蒸馏酒的相关研究中以GC-IRMS 的运用最为广泛。GC-IRMS 可用来分析白酒的多种稳定同位素比值，如白酒中乙醇或其他组分的δ13C、δ18O 和δ2H。国内白酒掺伪鉴别大多围绕白酒的碳稳定同位素展开研究[12]，同时分析白酒中乙醇C、O、H 稳定同位素比的相关研究还鲜有报道。本研究通过分析白酒、工业酒精、食用酒精中乙醇δ13C、δ18O 和δ2H 值的差异，考察乙醇C、O、H稳定同位素在白酒掺伪鉴别中的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

白酒样品：由贵州省产品质量检验检测院提供，共21 个白酒品牌、28 批次白酒样品。另外收集到7个工业酒精和5个食用酒精。

耗材及试剂：稳定同位素比参考物质为实验室自行校定的色谱纯乙醇（δ13C=-31.744‰±0.006‰；δ18O=27.883 ‰ ±0.116 ‰ ；δ2H=-263.372 ‰ ±2.258‰），乙腈（色谱纯，美国Sigma-Aldrich）。

仪器设备：气相色谱-稳定同位素比质谱联用仪(Delta V Advantage)，美国Thermo Fisher；电子天平(XP6)，瑞士Mettler Toledo；智能酒精度检测仪（STAW100），济南盛泰电子科技有限公司；INNOWAX 气相色谱柱（30 m×0.250 mm，0.25 μ m），美国Agilent。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

采用智能酒精度检测仪对白酒样品和酒精样品进行酒精度检测，用乙腈稀释至乙醇浓度约8 mg/mL，密封备用。

1.2.2 GC-IRMS条件

设置进样量1 μ L，进样口温度200 ℃，载气为高纯氦。GC 升温程序：起始温度45 ℃，保留2 min，以20 ℃/min 速度升至180 ℃，保持2 min。测定δ13C 时，燃烧管梯度升温至1030 ℃，参考气选择CO2；测定δ18O 时，氧裂解管梯度升温至1280 ℃，参考气选择CO；测定δ2H 时，氢裂解管梯度升温至1420 ℃，参考气选择H2。样品在50 s 时切入，切入时长75 s，参考气分别在180 s、230 s 和280 s 时切入20 s。

1.2.3 数据处理

Isodat version 3.0 软件用于同位素值的计算和数据获取。试样乙醇δ13C、δ18O 和δ2H 值采用实验室自行校定的色谱纯乙醇进行校正。

2 结果与分析

2.1 前处理条件优化

酒精以及白酒中的乙醇浓度较高，直接进样会造成信号过载，影响数据的准确度，也容易造成质谱污染。为了确保检测数据的准确性和仪器精密度，通过改变稀释比例、进样量和分流比等可将目标峰的信号强度调整至合理范围。在稀释过程中，稀释溶剂选用纯乙腈，一方面乙腈与酒精或白酒样品可很好的互溶；另一方面乙腈中各元素不会与样品中乙醇的C、O、H 发生置换影响乙醇的稳定同位素比值。通过气相色谱将乙醇和乙腈完全分离，可准确检测样品中乙醇的δ13C、δ18O 和δ2H 值。本次收集的28 批次白酒的酒精度分布在38 %vol～52%vol范围，根据经验，用乙腈将样品直接稀释50倍，即可得到乙醇最终浓度约8 mg/mL 的稀释样液，以供GC-IRMS分析。然而质谱的灵敏度较高，8 mg/mL 的乙醇浓度仍偏高，因此，在进样量选取时，选择进样针的最小准确进样体积1 μ L，再通过调节分流比进一步调整目标峰的响应强度。分别设置分流比为5∶1、10∶1、25∶1、50∶1、100∶1、200∶1和500∶1，对同一稀释样液分别检测样品CO2、CO、H2目标峰，得到目标峰的信号响应结果如图1 所示。根据IRMS 经验，目标峰的响应度与参考气峰的响应度相近时具有较好的准确度，已知参考气峰的响应度在3000～4000 mV，即样品目标峰信号强度在此范围时对应的分流比为最佳条件。因此，检测δ13C 时分流比设置为50∶1；检测δ2H 时分流比设置为25∶1；检测δ18O 值时分流比设定为10∶1，以便得到更准确的稳定同位素比结果。

图1 不同分流比时CO2、CO、H2目标峰的响应度

图2 工业酒精、食用酒精和白酒的δ13C、δ18O、δ2H值分布

2.2 样品测定结果

采用优化后的GC-IRMS 方法分别对28 种白酒、7 种工业酒精和5 种食用酒精进行检测，得到各试样乙醇δ13C、δ18O和δ2H值如表1所示。

表1 各试样的酒精度和乙醇δ13C、δ18O、δ2H 值

40个试样的乙醇δ13C值最大极差为0.21‰，标准偏差（SD）均＜0.2‰，表明δ13C 测定结果稳定性较好。生产白酒所用原料的δ13C 值与成品白酒乙醇δ13C 值之间存在相关关系，原料δ13C 值决定酿造后白酒乙醇δ13C 值的分布范围[13]。在白酒的酿造中，主要以高粱、小麦为主，部分白酒为了保证独特的香味，原料中还添加了大麦、玉米、豌豆、糯米等粮食作物，其中小麦、豌豆、糯米等是常见的C3 植物，δ13C 值多分布在-34 ‰～-20 ‰之间，而高粱、玉米等是典型的C4 植物，δ13C 值多分布在-17‰～-8 ‰之间[14]，以这些原料通过不同配比进行酿造得到的白酒乙醇δ13C 值基本分布在-30‰～-10‰范围内。本实验28 种白酒样乙醇δ13C 值分布在-25.576‰～-17.028‰之间，符合上述范围，且与其他文献[15-17]中报道的基本一致，说明测得的乙醇δ13C 值是合理的。食用酒精的乙醇δ13C 值分布范围为-27.000‰～-17.876‰，与白酒乙醇δ13C值差异较小，可能是因为食用酒精同样以谷物、薯类等粮食作物为原料，与白酒酿造的原料之间δ13C差异不大，而原料的δ13C 值往往对成品δ13C 值起决定性作用，使得食用酒精乙醇δ13C 值与白酒乙醇δ13C 值之间差异不明显。工业酒精δ13C 值与白酒乙醇δ13C 值之间存在显著差异，可能与工业酒精的生产工艺有关，工业酒精主要由化工生产得到，原料来自于化工产品，原料与酿造酒精生产原料之间存在较大差异。鉴于白酒、食用酒精和工业酒精乙醇δ13C 值差异，说明碳稳定同位素可运用于鉴别白酒是否有掺假工业酒精；食用酒精与白酒样乙醇δ13C 值差异较小，采用碳稳定同位素鉴别白酒是否掺假食用酒精具有一定局限性。

40个样品的乙醇δ18O值最大极差为0.26‰，标准偏差（SD）均＜0.2‰，表明δ18O 测定结果稳定性较好。从白酒、食用酒精到工业酒精的乙醇δ18O值依次呈现明显的富集趋势。白酒乙醇δ18O 值分布范围较窄，28 种白酒样的乙醇δ18O 值分布在-3.689 ‰～1.205 ‰之间，与食用酒精和工业酒精存在较大差异。工业酒精的乙醇δ18O 值最高，分布范围为18.524 ‰～27.883 ‰，食用酒精的乙醇δ18O 值为9.241‰～16.787‰，介于工业酒精与白酒样之间。白酒乙醇δ18O 值与工业酒精和食用酒精乙醇δ18O 值之间存在显著差异，说明氧稳定同位素在鉴别白酒掺假工业酒精和食用酒精方面具有较大的潜力，且对工业酒精掺假鉴别的能力优于食用酒精掺假。

H 由于质量轻，同位素分流效应较大，δ2H 值稳定性不如δ13C 和δ18O。40 个样品经过H3+校正后的乙醇δ2H 值最大极差为2.3 ‰，标准偏差（SD）均＜2.5 ‰，小于仪器稳定性要求的3 %[18]，δ2H 测定结果满足要求。从δ2H 结果来看，白酒样、食用酒精和工业酒精的乙醇δ2H 之间差异较小，相互之间存在较大范围的交叠：白酒乙醇δ2H 值分布范围为-257.264 ‰～-224.658 ‰；工业酒精乙醇δ2H 值分布范围为-277.128‰～-244.021‰；食用酒精乙醇δ2H值分布范围为-252.324‰～-233.680‰。三者乙醇δ2H 值差异较小，说明δ2H 值在鉴别白酒样是否掺假食用酒精或工业酒精中存在较大困难。值得注意的是，在白酒的生产过程中，由于引入了大量的水，乙醇的羟基H/D由于解离与水解离的H/D 发生置换反应，会影响到原始乙醇的δ2H 值，使得乙醇δ2H 值与生产原料的δ2H 值之间存在一定差异，不利于乙醇的生产溯源和掺伪鉴别。

3 结论

本研究采用GC-IRMS 同时对白酒、食用酒精和工业酒精中乙醇δ13C、δ18O、δ2H 值进行了检测分析和数据比对，根据C、H、O 3 种稳定同位素比的差异发现：氧稳定同位素在鉴别白酒掺假食用酒精和工业酒精方面具有较大的潜力；碳稳定同位素可运用于鉴别白酒是否有掺假工业酒精，但在食用酒精掺假方面具有一定局限性；氢稳定同位素由于差异性小，稳定性不如碳、氧稳定同位素，受水中H/D影响等多重因素，在鉴别方面存在一定困难。根据钟其顶等[19-20]的研究，将样品中乙醇转化为乙酸钙，原乙醇的羟基H/D 由于被氧化去掉，乙醇甲基H/D被保留在乙酸钙中，通过测乙酸钙的δ2H 值得到乙醇的甲基位的氢稳定同位素比，该方法能有效避免水影响乙醇δ2H，便于通过氢稳定同位素研究酿造乙醇与原料的关系，在溯源和掺假方面具有重要的研究意义。