基于网络药理学及分子对接研究金珍滴眼液治疗干眼作用机制

吴改萍，余涵，张向东，刘海凤，朱晓谦，任芳芳

新乡医学院第三附属医院眼科，河南 新乡 453000

干眼是由泪膜稳态失衡和眼表刺激症状组成的多因素眼表疾病，可伴有眼表炎症和损伤以及神经感觉异常[1]。世界范围内干眼病发病率大约在5.5%～33.7%，我国干眼的发病率为21%～30%，女性和老年人群是干眼多发人群[2]。干眼常见的眼部症状有干涩感、异物感、烧灼感、眼红、畏光、疲劳感和视物模糊等，严重影响人们的正常生活。目前，西医采用药物及手术治疗干眼，如人工泪液、免疫抑制剂、激素、泪点封闭术[3]、角结膜移植[4]、颌下腺移植等[5-7]，但均具有相关风险，治疗不稳定、作用不持久。近年来，随着对中医药的深入研究，中药外治、内服及针灸治疗等在改善干眼患者泪膜稳定、减轻眼部不适症状方面发挥重要作用。

干眼属中医白涩症、干涩昏花、神水将枯症[8]等疾病范畴。《灵枢·大惑论》曰：“五脏六腑之精气，皆上注于目而为之精。”意在指出人体五脏六腑化生之精微物质通过经络到达目珠并濡养之。干眼的病因病机主要为肝郁气滞、肝经郁热、肺阴不足、气阴两虚等，致津液不得正常输布于目，久则目珠干涩乏泽，与肝、肺密切相关[3-4，9]。金珍滴眼液可疏风、清热、明目，调畅气机，临床研究发现，其治疗干眼、视频终端视疲劳等方面均有较好疗效[10-11]，但其具体作用机制尚不明了。本研究基于网络药理学及分子对接，研究金珍滴眼液治疗干眼的药物有效成分及作用靶点，分析其调控通路信息等，为深入研究提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 金珍滴眼液化学成分和作用靶点筛选 金珍滴眼液（Jinzhen Eye Drops，JZED）由金银花、密蒙花、野菊花、薄荷、珍珠、冰片组成，通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）和中药综合数据库（TCMID），使用关键参数口服生物利用度（OB）≥30%和药物相似性（DL）≥0.18 作为药物筛选的条件，记录符合要求的相关化学成分及对应靶点。使用Uniprot 蛋白质数据库，检索干眼名称，得到目标药物-人源靶标蛋白-基因名的相互关系。

1.2 干眼靶点基因获取 通过GeneCards 和OMIM 数据库，以“dry eye”为关键词进行检索，得到干眼相关的基因靶点。

1.3 药物-干眼-靶点调控网络的构建 利用RGUI软件Venn 库绘制得到药物-干眼-靶点韦恩图，通过Cytoscape V3.8.2 构建有效成分-干眼-靶点调控网络。在STRING（https：//cn. string-db. org/）数据库， 以interaction score ＞0.95 为作用阈值，构建蛋白质相互作用（PPI）网络，再利用Cytoscape 获得PPI 网络核心靶点。

1.4 关键靶点的基因本体（GO）和KEGG 通路富集分析 利用RGUI软件的Cluster Profiler 库，以人类基因数据库（org.Hs.eg.db）和KEGG 数据库为数据源，设置P＜0.05 进行GO 和KEGG 通路富集分析和可视化显示，根据富集分析结果筛选靶基因，说明金珍滴眼液中的有效靶蛋白在基因功能表达以及相关信号通路中所起的重要作用。

1.5 分子对接验证 根据PPI 筛选出的关键靶点，在有机小分子生物活性数据（Pubchem）得到核心蛋白结构，将水分子以及结合的配体利用PyMOL V2.4 软件去除，将配体和受体文件导入AutoDockTools、Vina 软件对金珍滴眼液的主要活性成分和核心靶点进行分子对接实验，获得对接评分，验证其相互作用的活性。

2 结果

2.1 药物有效成分及作用靶点筛选结果 以OB ≥30%和DL ≥0.18 为条件，在TCMSP 和TCMID 数据库中对金珍滴眼液中药活性成分进行检索，得到59 种化合物，其中冰片3 种，薄荷10 种，金银花23 种，密蒙花4种，野菊花12种，珍珠7种。根据化合物相关靶点，结合UniProt 数据库，共涉及257 个人类基因Symbol。

2.2 药物有效成分和干眼共同靶点筛选结果 利用GeneCards 和OMIM 数据库，以Relevance score＞1 为条件，共获取干眼相关疾病靶点3 603 个。将目标药物中的成分靶点与干眼靶点相交，取共同交集，获得221 个共同作用靶点，见图1；利用Cytoscape V3.8软件构建有效成分-干眼-靶点互作网络，见图2；其中薄荷为蓝色（#0040ff），金银花为绿色（#80ff00），密蒙花为紫色（#9900cc），野菊花为青色（#00ffff），珍珠为黄色（#ffbf00），冰片为红色（#ff0000）。根据连接度，quercetin、luteolin、kaempferol、naringenin、beta-sitosterol等化合物可能是金珍滴眼液治疗干眼的关键活性成分，见表1。

表1 金珍滴眼液治疗干眼的关键活性成分

图1 药物有效成分靶点和干眼靶点韦恩图

图2 中药复方调控网络

2.3 PPI网络核心构建 利用STRING 数据库，获取221 个交集靶点的网络拓扑数据，将数据导入Cytoscape软件，经2次过滤，得到金珍滴眼液作用于干眼的PPI 核心网络图，得到221 个靶点，573 条边，节点平均连接度5.19，见图3。推测AKT1、TP53、HSP90AA1、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、ESR1、肿瘤坏死因子（TNF）、CTNNB1、白细胞介素-6（IL-6）、生长因子受体结合蛋白（GRB2）、表皮生长因子受体（EGFR）、PTPN11 为金珍滴眼液治疗干眼的关键靶点。

图3 金珍滴眼液治疗干眼相关靶点的PPI网络

2.4 GO 功能和KEGG 通路富集分析 使用RGUI软件Cluster Profiler 库中Enrich GO 富集功能函数，以P＜0.05 和q＜0.05 为阈值，得到3 045 个条目，其中生物过程（BP）2 664 条，细胞组成（CC）149 条，分子功能（MF）232 条。根据P值排序，取前30 条绘制可视化图形，见图4。

图4 金珍滴眼液治疗干眼的GO富集分析

使用RGUI 软件clusterProfiler 库中enrichKEGG 富集功能函数，以阈值P＜0.05和q＜0.05进行分析，得到190条信号通路，取前30条绘制可视化图形，见图5。

图5 金珍滴眼液治疗干眼的KEGG富集分析

2.5 关键靶点的分子对接 根据有效成分和疾病共同靶点网络中活性成分，将Degree 较高的10 个活性成分与查阅文献后保留的AKT1、TP53、HSP90AA1、MAPK3、TNF、IL-6、EGFR 共7 个密切度高的关键靶点进行分子对接。一般认为结合能数值小于-7 kcal/mol 表明受体和配体具有较好的亲和力，见表2、图6。

表2 核心蛋白与活性成分对接结合能结果 kcal/mol

图6 分子对接结果

3 讨论

干眼是一种由于泪液不足或泪液过度蒸发而导致泪膜内稳态丧失、眼表受损及眼部不适症状有关的眼表疾病[12]，眼表泪膜不稳定、炎症和损伤、泪液高渗透性、神经感觉异常以及眼表微环境失衡等是导致干眼的主要病因[1，13]。干眼诱导的泪膜高渗性抑制PI3K/AKT 信号传导，PI3K/AKT 信号传导是角膜上皮细胞（CECs）炎症、自噬和细胞凋亡发生和发展的部分原因，在体内和体外实验中，高渗透压可能通过抑制CECs中PI3K/AKT信号传导，以剂量依赖的方式增加HMGB1、肿瘤坏死因子（TNF-α）和IL-1β 的表达[14]，因此，PI3K/AKT 信号的再激活可能是治疗干眼的有效方法。

中药复方常按君臣佐使配伍规律以增效祛邪。金珍滴眼液中金银花归肺经，可清热解毒、疏散风热，密蒙花归肝胆经，可清热泻火、养肝明目、退翳，共为君药；野菊花味苦入肝，清泻肝火，兼散风热，为臣药；冰片、珍珠共为佐药，主散郁火，可清热止痛、泻火解毒、明目退翳；薄荷为使药，疏散风热，调和诸药，全方具有疏风、清热、明目之功效。

本研究结果显示，金珍滴眼液包含34 个有效化合物，具有较高连接度的化合物包括天然黄酮类以及强抗氧化类成分等。

Quercetin 存在于金银花、野菊花，具有抗炎作用，可调节NO、IL-6 和TNF-α 等炎症介质的释放[15-16]，从而减轻组织中的氧化损伤，并抑制脂多糖（LPS）诱导的延迟自发细胞凋亡和中性粒细胞活化。高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是染色质结合因子，警报素家族成员之一，在核稳态中发挥关键作用。研究显示，各种眼表疾病，如结膜炎和干眼的患者泪液中发现了HMGB1，在静止状态下，它可以定位细胞内的炎症介质，但释放到外部可以激活先天免疫反应，引起炎症反应的恶性循环，参与组织损伤[17-20]。研究表明，槲皮素可抑制NLRP3 炎症小体的激活及MAPKs、JAK/STAT、NF-κB 和细胞凋亡通路，以及激活Nrf2、AMPK、BDNF/CREB、Wnt/β-Catenin、PI3k/Akt 通路和SIRT1 介导的HMGB1 脱乙酰化[21]。在巨噬细胞培养中，槲皮素抑制HMGB1的释放和细胞因子活性，包括限制MAPKs 和NF-κB的激活，这两种信号通路对HMGB1 诱导的后续细胞因子释放至关重要。Li H 等[22]证实，激活PI3K/Akt通路后，使得HMGB1 的蛋白表达下调，眼表炎症反应及高渗性反应均减轻，从而有效治疗干眼。

Luteolin 存在于金银花、密蒙花、野菊花及薄荷中，是最具生物活性的黄酮类化合物之一[23]，在各种炎症和神经退行性疾病模型中，已证明其具有细胞保护、神经保护和神经原性活性等有益作用[24-26]。研究表明，luteolin 可减少角膜组织中促炎因子IL-1β、IL-6、IL-18、皮质酮、IL-17和IL-23和TNF-α 的分泌，上调SIRT1 表达，下调Ac-NF-κB、NLRP3、Ac-Caspase-1、 GSDMD-N、 Cleaved IL-1β 和Cleaved IL-18 表达，还可调节Notch、FOXO、TNF、P53、Hippo、多巴胺能神经突触和神经营养因子通路，减轻抑郁相关性干眼症模型的抑郁样行为，增加结膜上皮杯状细胞数量，减轻干眼症状[27]。在大鼠静脉内皮细胞培养物中的结果表明，luteolin 可有效降低活性氧（ROS），从而改善静脉内皮细胞中一氧化氮的利用率[28]。

Acacetin 存在于密蒙花、野菊花、薄荷中，具有抗炎、抗氧化、抗癌等多种生物活性，研究显示，acacetin可抑制TLR4表达，从而减轻角膜氧化应激损伤和炎症反应，保护干眼模型大鼠眼表稳态和泪腺功能[29]。

Asiatic acid 存在与冰片中，具有抗氧化、抗炎、抗自由基、细胞保护、细胞凋亡调节、受体和酶调节活性等生物活性[30]。在各种体外和体内研究中，asiatic acid 也被发现影响生长因子、转录因子和细胞信号传导，具有抗癌、降压、保心、抗梗死、抗中风、降血脂、降糖、保肝、保胃、保肾、利尿、免疫刺激、神经保护、抗真菌、抗细菌、抗病毒等作用[31]。

金珍滴眼液有效成分中包含的naringenin、betacarotene 等强抗氧化类成分，可通过上调PI3K/AKT/Nrf2 通路，促进抗氧化物质的表达水平和ROS 等氧化物质的清除[32]。研究表明，高渗透压和ROS积累会抑制干眼中的PI3K/AKT 信号传导，角膜上皮细胞（CEC）各种生长因子，包括EGFR 配体、IGF1、神经激肽（NK-1）和胰岛素，通过结合其受体激活PI3K/AKT 信号通路，促进角膜上皮（CE）的抗凋亡、抗炎、增殖、迁移功能和伤口愈合[14]。ROS 以浓度依赖性方式调节CEC 中的细胞凋亡和炎症。极端环境会导致ROS 过量积累，抑制PI3K/AKT，导致CEC 细胞凋亡和炎症。在低或中等水平时，ROS 会激活PI3K/AKT信号传导，抑制细胞凋亡并刺激健康CEC的增殖。

根据PPI核心网络，得到金珍滴眼液治疗干眼的潜在重要靶点有AKT1、TP53、HSP90AA1、MAPK3、TNF、IL-6、EGFR 等。AKT1 是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的一种，在细胞增殖、免疫、血管生成、炎症、抑制凋亡、能量代谢等信号通路中起着重要作用。TP53 是一种包含转录激活、DNA 结合和寡聚结构域的抑癌蛋白，可通过编码蛋白参与调节靶基因，诱导诸多细胞的应激反应，调节细胞DNA 修复、衰老、凋亡等。HSP90AA1是高度保守的分子伴侣，在信号转导、蛋白质折叠、蛋白质降解和形态学进化中起着关键作用。MAPK3 基因编码的蛋白质是MAP 激酶家族的一员，作用于一个信号级联，调节各种细胞过程，如增殖、分化和细胞周期进程。TNF是健康生物体和患病条件下哺乳动物免疫反应的关键介质和调节剂，控制免疫系统的发育、细胞生存信号通路、增殖并调节代谢过程[33]。IL-6是重要的炎症细胞因子之一，在眼表疾病，特别是干眼、角膜病变、葡萄膜病变、玻璃体视网膜异常中均有表达，并在结膜、角膜、虹膜、视网膜和眼眶的眼部炎症和血管生成中发挥重要作用[34]。EGFR是一种表皮生长因子受体，通过结合PI3K/AKT 受体可激活其信号通路，促进CE的抗凋亡、抗炎、增殖和伤口愈合。

GO 和KEGG 富集分析结果显示，金珍滴眼液治疗干眼涉及外源性刺激反应、营养水平反应、细菌来源分子反应、细胞对化学及氧化应激的反应、活性氧反应等与生物过程相关；与膜筏、膜微区、囊泡腔、神经细胞体、细胞质囊泡腔、管腔颗粒分泌因子、突触后膜等细胞组成相关；并涉及DNA 结合转录因子结合、信号受体激活剂活性、细胞因子受体结合、细胞因子活性、转录协同调节因子结合、蛋白磷酸酶结合等分子功能。关键靶点主要集中在PI3K-Akt、TNF、IL-17、MAPK、EGFR 等信号通路上。分子对接结果显示，金珍滴眼液的活性成分与TP53、HSP90AA1、MAPK3、TNF、IL-6 的结合活性较强，证明网络药理学对预测药物金珍滴眼液成分与干眼靶点之间的可靠性。综上所述，金珍滴眼液的活性成分可经由多途径发挥治疗干眼的作用，这些靶点-通路间的相互作用关系可为后续研究提供方向，也为金珍滴眼液治疗干眼的临床应用和发展提供更广阔的前景。

本研究通过网络药理学和分子对接的方法，对金珍滴眼液治疗干眼进行靶点预测，构建中药复方调控网络、PPI 分析，结果发现，金珍滴眼液治疗干眼可能的活性成分主要包括acacetin、quercetin、luteolin、beta-carotene、asiatic acid 等，这些活性成分通过作用于TP53、HSP90AA1、MAPK3、TNF、IL-6 等靶点和PI3K-Akt、 TNF、 IL-17、 MAPK、EGFR 等信号通路，进而从抗炎、抗细胞凋亡、减轻氧化应激以及细胞保护、神经保护等方面增加结膜上皮杯状细胞数量、促进角膜上皮修复，减轻高渗反应，改善泪膜稳态等途径达到治疗干眼的作用。