基于数据挖掘及网络药理学方法探究朱文宗治疗神经性失眠伴焦虑状态用药规律及机制

谢佳峄，蒋越，陈婷婷 指导：朱文宗，3

1. 浙江中医药大学附属温州市中医院，浙江 温州 325029

2. 温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325015

3. 温州市中西医结合医院，浙江 温州 325001

神经性失眠是无明确病因下出现的或入睡困难、或睡而不深、或多梦早醒等现象[1]，影响躯体、精神功能[2]。有调查结果显示，我国存在失眠的人群达45.2%，有30.8%的失眠受访者精神焦虑与睡眠障碍并存[3]。有研究表明，失眠与焦虑存在双向性影响，会导致症状愈发严重[4]。现代医学治疗神经性失眠伴焦虑状态，多使用苯二氮䓬类药物联合5-羟色胺（5-HT）受体拮抗剂等[5]，起效虽快，但有较多的患者出现不良反应。

朱文宗教授是主任中医师、第四批全国中医临床优秀人才，师承于国医大师王琦院士，继承并发扬了王琦院士对中医腹诊的独到见解。其在临床上将腹诊与中医四诊结合，更全面、客观地诊察疾病，活用经方。朱文宗教授将经方与腹诊理论运用于临床数年，对神经性失眠伴焦虑状态的诊疗具有独到的认识。本研究通过数据挖掘和网络药理学的方式探究朱文宗教授治疗神经性失眠伴焦虑状态的中药处方，归纳朱文宗教授的用药经验，分析内在机理。

1 资料与方法

1.1 处方收集 收集2020年2月—2022年12月朱文宗教授于浙江中医药大学附属温州市中医院治疗神经性失眠伴焦虑状态患者的中药处方。神经性失眠伴焦虑状态的诊断均参考《中国精神障碍分类与诊断标准第三版（精神障碍分类）》[6]。筛选出308 份处方纳入研究，将处方数据录入Excel 软件，建立数据库。使用IBM SPSS Statistics 26 软件对处方中患者的基本信息（性别、年龄）进行统计，308 份处方中包括男114 例（37%），平均年龄（50.25±1.29）岁；女194 例（63%），平均年龄（50.84±0.91）岁。

1.2 数据规范化 参考《中华人民共和国药典：一部》[7]及《中药学》[8]对1.1 项的Excel 数据库进行标准化处理，如“仙灵脾”统一更改为“淫羊藿”，“巴戟肉”统一更改为“巴戟天”等。功效相近的炮制后的药物名称均统一为生品的中药名称，如“姜半夏”“法半夏”统一更改为“半夏”，“麸炒白术”“生白术”统一更改为“白术”等。建立中药处方数据库。

1.3 数据挖掘 将1.2项的中药处方数据库导入中医传承计算平台V3.0，通过“数据分析”模块，经由“统计分析”和“方分析”功能，得出中药频次、中药类别以及中药性、味、归经的分析结果。排序筛选得出高频药物数据后，将其导入IBM SPSS Modeler 18.0软件，得到高频药物复杂网络图，再采用Apriori算法对高频药物进行关联规则分析。通过上述数据挖掘结果，将药物频次、支持度、置信度及链接强度最高的药物组合归纳，得出核心药物组。

1.4 网络药理学分析

1.4.1 核心药物活性成分及作用靶点筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），设置口服生物利用度（OB）≥30%及类药性（DL）≥0.18，筛选核心药物组的活性成分及作用靶点，因核心药物中甘草主要起到调和诸药的作用，故将其省去。后通过UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/）统一标准化筛选得到的作用靶点名称。

1.4.2 疾病靶点筛选 以“insomnia”“anxiety”为检索词，分别在DrugBank数据库（https：//www.drugbank.com/）、基因组注释数据平台（GeneCards）（https：//www.genecards.org/）、药物靶标数据库（TTD）（http：//db.idrblab.net/ttd/）以及在线人类孟德尔遗传（OMIM）数据库（https：//omim.org/）中进行检索，并通过Uniprot数据库将靶点名称进行统一标准化规范。

1.4.3 疾病-核心药物-成分-靶点网络构建 通过R 语言软件将核心药物活性成分的作用靶点与疾病靶点取交集，得到药物-疾病交集靶点，并绘制韦恩图。再将核心药物活性成分及其作用靶点与药物-疾病交集靶点导入Cytoscape 3.9.1 软件构建“疾病-核心药物-成分-靶点”网络图，筛选出核心活性成分。

1.4.4 蛋白质互相作用（PPI）网络分析 将药物-疾病交集靶点导入STRING 数据库（https：//string-db.org/），设置置信度≥0.400后进行计算，将计算得出的结果数据导出后，导入至Cytoscape 3.9.1 软件，进行可视化操作，根据度值（degree）获得关键活性成分。

1.4.5 基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将核心药物和疾病的共同核心靶点导入Metascape 数据库（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），进行GO 功能富集分析和KEGG通路富集分析，将结果筛选导入微生信云平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）以及Cytoscape 3.9.1软件进行可视化处理。

2 研究结果

2.1 高频药物统计结果 见表1。本研究共纳入处方308 个，涉及中药共计174 味，累计使用频次4 064 次。将174 味中药按照分类排序，包含药物最多的5 类分别为补虚药（30 味）、清热药（22 味）、解表药（17 味）、活血化瘀药（15 味）和安神药（10 味）。将处方中所有药物按照使用频次排序，并计算其在308 个处方中的使用频率，其中使用频次≥60 次的高频药物共20 味，可推测为朱文宗教授治疗神经性失眠伴焦虑状态的常用药物，输入高频中药数据，建立高频中药数据库，其中使用频次排在前5位的药物依次为甘草、半夏、黄芩、柴胡、党参。

表1 高频药物统计结果（频次≥60次）

2.2 中药性、味、归经统计结果 见图1～3。将174 味中药进行性、味、归经分析，结果显示，药性以温性为主，其次为平性、微寒性等。药味以辛味为主，其次为苦味、甘味等。归经以肺、脾两经为主，其次为心经、肝经、胃经。

图1 中药四气雷达图

图2 中药五味雷达图

图3 中药归经雷达图

2.3 高频药物关联规则分析结果 见表2。将2.1 项的高频中药数据导入IBM SPSS Modeler 18.0 软件进行关联规则分析，采用Apriori 算法，设置最大前项数为2，最低条件支持度为50%，最小规则置信度为80%。按支持度从高到低对核心药对进行排名，取前12组信息。得出结果增益均大于1，说明筛选得出的药对均具有正相关性，可见由半夏-黄芩-甘草-党参-柴胡组成的药物组合具有较高支持度。

表2 高频药物关联规则分析结果

2.4 复杂网络分析 将2.1 项的高频中药数据导入IBM SPSS Modeler 18.0 软件，将计算结果导入Cytoscape 3.9.1软件，绘制高频药物关联网络图（见图4），代表药物的圆颜色越深、形状越大，则说明该药物使用频率越高（即2.1 项的高频药物），药物之间的线条颜色越深、宽度越粗，则说明药物之间的链接越强。根据图4 可见，半夏、黄芩、甘草、柴胡、党参之间存在强链接。

图4 高频药物关联网络图

2.5 网络药理学分析 通过上述结果筛选得出核心药物组为半夏-黄芩-柴胡-党参（去调和之甘草），采用网络药理学方法对其进行分析。

2.5.1 核心药物活性成分及作用靶点筛选 通过在TCMSP 数据库检索，筛选得到半夏、黄芩、柴胡、党参的活性成分，分别为半夏13 个、黄芩36 个、柴胡17 个、党参21 个，删除重复靶点以及无对应靶点信息后，得出上述活性成分作用靶点，共计311个。

2.5.2 “疾病-核心药物-成分-靶点网络图”构建分别从DrugBank 等数据库检索疾病靶点，在GeneCards 数据库检索结果中设置Relevance score≥1 筛选核心靶点信息，将各个数据库检索出来的结果合并，删除重复值，得到478 个失眠相关靶点、1 655个焦虑相关靶点，两种疾病的相同靶点共335个，通过R 语言软件将311 个药物靶点与疾病相同靶点取交集，得到63 个药物-疾病交集靶点，并绘制韦恩图，见图5。将核心药物的活性成分及其作用靶点和药物-疾病交集靶点导入Cytoscape 3.9.1 软件，删除不相关联的活性成分，绘制疾病-核心药物-成分-靶点网络图，见图6。可见相关联的活性成分有63 个，根据度值进行排序，排名前10 的核心活性成分包括豆甾醇、槲皮素和β-谷甾醇等，详见表3。

图5 药物-疾病交集靶点韦恩图

图6 疾病-核心药物-成分-靶点网络图

表3 度值排名前10的核心活性成分

2.5.3 PPI网络构建 将63个药物-疾病交集靶点导入STRING 数据库，选择置信度≥0.400，将结果文件导入Cytoscape 3.9.1软件绘制PPI网络图，见图7。根据度值取中位值进行筛选，连续筛选2次，得到核心靶点，共计15 个，分别为血管内皮生长因子A（VEGFA）、白细胞介素8（IL8）、前列腺素G/H 合酶2（PTGS2）、白细胞介素1β（IL1B）、淀粉样β 蛋白前体（APP）、钠依赖性多巴胺转运体（SLC6A3）、钠依赖性5-羟色胺转运体（SLC6A4）、细胞色素P450 3A4（CYP3A4）、白细胞介素6（IL6）、神经元乙酰胆碱受体亚基α-7（CHRNA7）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）、5-羟色胺受体2C（HTR2C）、雌激素受体（ESR1）、白细胞介素10（IL10）、肿瘤坏死因子（TNF）。见图8。

图7 PPI网络图

图8 核心靶点筛选过程

2.5.4 富集分析结果 对核心靶点进行GO 功能富集分析（P＜0.05），结果为610 个生物过程（BP）、60 个细胞组分（CC）、119 个分子功能（MF）。BP 主要包括细胞对儿茶酚胺和乙酰胆碱的反应、突触信号等；CC主要包括突触、树突、受体复合物等；MF则主要展现在受体活性，如神经递质受体活性、5-HT 受体活性等。见图9。

图9 GO功能富集分析结果

KEGG 通路富集分析得到112 条通路，其中包括神经活性配体-受体相互作用、多种疾病-神经退行性变的通路、雌激素信号通路等。见图10。将KEGG通路富集分析结果按照校正后的P值排序，取前20 条信息导入Cytoscape 3.9.1 软件绘制KEGG 核心通路-基因图（见图11），可见核心药物可能通过神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、多种疾病-神经退行性变的通路、5-HT 能突触、脂质与动脉粥样硬化、流体剪切力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物及其受体（AGE-RAGE）信号通路、阿尔茨海默病等通路发挥效能，且根据P值，关联最密切的作用靶点包括TNF、IL1B、IL6、CASP3、钙调蛋白1（CALM1）。

图10 KEGG通路富集分析结果

图11 KEGG核心通路-基因图

3 讨论

神经性失眠伴焦虑状态表现为夜寐不安、入寐难，或多梦、早醒，同时伴有精神紧张、情绪激动、焦虑担心等症状，归属于中医学不寐及郁证范畴。朱文宗教授认为神经性失眠伴焦虑状态的发病病机主要是营卫失和以及脏腑失调两个方面。《灵枢·大惑论》言：“卫气……不得入于阴，则阴气虚，故目不瞑矣。”阳不入阴，营卫失和，则不得寐。《素问·阴阳应象大论》云：“人有五脏化五气，以生喜怒悲忧恐。”即人体的情志由五脏之气所生，情志失衡，提示五脏功能失调。临床上，神经性失眠伴焦虑状态可大体归为虚、实两类，实者夹痰、夹瘀、夹气郁，虚者脏腑、阴阳、气血虚。故治以健脾理气、益气养阴之法，兼以疏肝和胃、养心安神。

根据高频药物使用频次分析结果显示，朱文宗教授治疗神经性失眠伴焦虑状态的用药以补虚药（甘草、党参、当归、黄芪），清热药（黄芩、栀子、黄连），解表药（柴胡），安神药（茯神、远志、首乌藤、合欢皮、酸枣仁），理气药（陈皮、枳壳），止咳化痰平喘药（半夏、竹茹）为主，其中使用频次较高的5味药物为甘草、半夏、黄芩、柴胡、党参，可初步推测朱文宗教授在治疗神经性失眠伴焦虑状态时多从肝论治，主要以小柴胡汤为底方，治以和解少阳、调畅肝气、和胃健脾。朱文宗教授言本病患者虽多从肝论治，但仍不能忘记顾护脾胃。《金匮要略》曰：“见肝之病，知肝传脾，当先实脾。”情志不舒，肝气郁滞，肝木乘脾土，脾胃乃气机之中枢，中枢不通，则上下壅堵，亦可加重气郁，郁而化火，继而不寐甚，所谓“胃不和则卧不安”是也，故可随证加减茯神、党参、白术之品健脾和胃。

朱文宗教授治疗神经性失眠伴焦虑状态患者时，往往结合伤寒派腹诊[9]进行诊治，若患者夜寐不安，情绪焦虑，兼见偏头或疼或紧，胁肋苦满，脉弦，面色发青，腹诊肋弓下肌群紧张，乃少阳郁滞，则予柴胡类方加减，其中形体适中或偏瘦小者，予小柴胡汤；形体壮实，面色红润有余，口苦，大便秘结，腹诊腹部紧实满者，予大柴胡汤。若兼见夜梦繁多，尤甚噩梦，性情急躁，腹胀，腹诊鼓音明显，脐旁压痛者，乃痰瘀气滞，可予癫狂梦醒汤加减，病程久而顽固者，可加蝉蜕镇静安神。若兼见心烦，口苦，盗汗，舌红少苔，腹部皮肤明显热于其他部位的皮肤，乃阴虚火旺，予天王补心丹加减。若见多梦，心悸，精神紧张，神疲乏力，头晕，恶心，脉滑，腹诊心下悸动[10]，乃水气上逆，予桂枝加龙骨牡蛎汤加减。若平素胆小易惊，苔腻，舌上可见半夏线，腹诊心下痞满者，乃气滞痰阻，予温胆汤加减，以顺调胆气、调理阴阳，乃“从胆论治”以调神、安神。兼见舌红、心烦实者，加黄连、栀子之品，虚者予丹参、赤芍之品。神经性失眠伴焦虑状态患者的舌诊多可见半夏线，关于半夏线的记载最早见于《辨舌指南》[11]：“故气郁之证，苔边整齐如石阶之起边线，线内有苔，线外无苔，但红边而已。”即舌边出现两条细长的唾沫白线。朱文宗教授指出，一般有此线者，多伴有情绪焦虑、紧张，脉弦，乃气郁之征，若兼见舌苔白滑腻，则为气郁湿阻，半夏征是也。

根据药物性、味、归经统计结果分析可得，朱文宗教授治疗神经性失眠伴焦虑状态时，常用药物的药性以温性、平性为多，药味以辛味、苦味为主，归经大都归肺、脾两经。温州地处依山傍水的海洋气候地区，湿患尤多，故朱文宗教授多选辛温之品燥湿平胃[12]。

关联规则分析结果显示，半夏、黄芩、柴胡、党参为朱文宗教授治疗神经性失眠伴焦虑状态的核心药物。网络药理学分析结果显示，核心药物有63 个活性成分与神经性失眠伴焦虑状态的疾病靶点相关，其中度值排名靠前的活性成分有半夏、黄芩、柴胡、党参共有的豆甾醇，柴胡的主要成分槲皮素，以及半夏和黄芩的共有成分β-谷甾醇。有研究结果表明，炎症因子可以调节脑血管血流动力学，影响睡眠[13]，而从核心药物中提取出的共有成分豆甾醇具有保护神经、抗炎、抗氧化、调节免疫等功能[14]。从柴胡中提取所得的槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、改善线粒体功能等作用[15]，可激活大鼠的γ-氨基丁酸受体从而改变睡眠周期，明显延长大鼠的非快速眼动睡眠期，与此同时缩短快速眼动睡眠期[16]，也可通过增加大鼠大脑中的谷胱甘肽过氧化物酶等方面，减轻大鼠的焦虑及睡眠障碍情况[17]。半夏和黄芩的共有成分β-谷甾醇具有抗焦虑、镇静、镇痛、抗炎等作用[18]。有研究结果表示，β-谷甾醇可减轻小鼠前额皮层和齿状回对压力、恐惧记忆的影响，同时减少与焦虑、记忆相关的原癌基因（FOS）的表达，从而减轻小鼠的焦虑[19]。

根据PPI网络分析筛选结果得出，核心药物治疗神经性失眠伴焦虑状态的核心靶点有VEGFA、IL8、PTGS2、IL1B、APP、SLC6A3、SLC6A4、CYP3A4、IL6、CHRNA7、CASP3、HTR2C、ESR1、IL10 等。有研究表明，炎症细胞因子如TNF、IL6 等可影响睡眠[20]。慢性失眠障碍患者血清中的TNF水平会显著增高[21]。故核心药物可能通过作用于炎症因子而起到治疗作用。再者，本研究纳入的处方中，女性患者有194 例，占63%，平均年龄（50.84±0.91）岁，考虑围绝经期女性可因性激素水平降低而出现失眠、焦虑、烦躁等表现[22]，故而更容易出现本病，笔者推测，核心药物可能通过作用于雌激素受体来改善病情。临床诊治时，朱文宗教授言及本病若遇围绝经期女性见畏寒肢冷，可予仙茅、淫羊藿、仙鹤草之品补益肝肾。结合GO、KEGG 富集分析结果，可以得到化学药物在治疗神经性失眠伴焦虑状态上，主要通过神经活性配体-受体相互作用[23]及多种疾病-神经退行性变的通路、钙信号通路[24]等，调控神经递质受体活性、5-HT 受体活性、血清素受体活性等，影响儿茶酚胺结合、乙酰胆碱结合等方面起到对神经性失眠伴焦虑状态的治疗作用，充分体现了中药治疗多成分、多靶点的特性。

综上所述，本研究发现，朱文宗教授治疗神经性失眠伴焦虑状态以健脾理气、益气养阴之法为主，兼以疏肝和胃、养心安神。常用的核心药物组为半夏、黄芩、柴胡、党参，该药物组的核心活性成分可能通过神经活性配体-受体相互作用等通路，作用于神经元的突触、树突，影响神经递质受体活性等方面发挥治疗效果，充分体现了中医药治疗疾病多成分、多靶点、多通路协同作用的特点。本研究仍有一定的局限与不足，具体应用仍需基于中医学理论，结合临床具体情况进行具体分析。