基于网络药理学方法和分子对接技术探讨芍药甘草汤合桃红四物汤治疗糖尿病周围神经病变的作用机制

刘莹，林旋，2，张珏，姚南珍，赵一涵

1. 广州中医药大学第八临床医学院，广东 佛山 528000

2. 佛山市第一人民医院，广东 佛山 528000

3. 佛山市中医院，广东 佛山 528000

糖尿病周围神经病变（DPN）是糖尿病常见的慢性并发症之一，早期可见四肢麻木、感觉异常、疼痛，晚期以感觉丧失为特征，若病情进一步发展，可导致足部溃疡、坏死，甚至需要截肢、危及生命，严重影响患者的生活质量并带来沉重的经济负担。目前，现代医学针对DPN 以对因对症治疗为主，包括调控血糖、改善循环、抗氧化应激、营养神经、止痛等[1]，这些针对DPN 单一发病机制采取的治疗措施并不能达到令人满意的临床疗效，治疗存在一定局限性。中医认识及治疗疾病强调从整体出发，在中医理论指导下形成的中药复方对DPN 的防治具有多成分、多途径、多靶点的综合优势，可标本兼治，有效改善临床症状[2]。临床研究表明，芍药甘草汤合桃红四物汤治疗DPN 有确切疗效[3-4]，但作用机制的分析探讨尚未见报道。网络药理学与分子对接技术可通过构建“活性成分-靶点基因-信号通路”网络，系统、整体地分析中药复方中多成分对疾病的作用机制，其特点与中医整体观、辨证施治原则相吻合[5]。本研究通过运用网络药理学方法及分子对接技术，分析芍药甘草汤合桃红四物汤治疗DPN 的作用机制，以期能为芍药甘草汤合桃红四物汤的临床应用及后期的深入研究提供依据与方向。

1 研究方法

1.1 芍药甘草汤合桃红四物汤化学成分信息及靶点基因获取 以口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18 作为筛选标准，从中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中检索白芍、甘草、桃仁、红花、川芎、熟地黄与当归，筛选出各药物的活性成分并下载对应的靶点蛋白，借助Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）将上述中药活性成分的靶点蛋白转换为对应的靶点基因。

1.2 DPN 靶点基因获取 以“diabetic peripheral neuropathy” 为关键词， 分别从DrugBank 数据库（https：//www.drugbank.ca/）、PharmGKB数据库（https：//www.pharmgkb.org/）、GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）、OMIM 数据库（https：//omim.org/）、TTD 数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）检索靶点基因，并对收集到的数据进行整理、去重，获得DPN 相关的靶点基因。

1.3 芍药甘草汤合桃红四物汤活性成分-DPN 共同靶点基因网络图构建 运用韦恩图（Venn diagram）得到芍药甘草汤合桃红四物汤活性成分与DPN 的共同靶点基因，即潜在治疗靶点基因。运用Cytoscape 3.9.1 软件对药物活性成分与潜在治疗靶点基因之间的关系进行网络图像可视化处理。活性成分与靶点基因以节点呈现，节点之间相互作用的关系以边表示。以“Degree”为标准将药物活性成分进行排序，筛选出芍药甘草汤合桃红四物汤治疗DPN 的核心活性成分。

1.4 蛋白质相互作用（PPI）网络构建 运用STRING数据分析平台（https：//string-db.org），将置信度调整为≥0.900，生物种类限制为“Homo sapiens”，获取芍药甘草汤合桃红四物汤活性成分与DPN 共同靶点基因的PPI 网络图。下载PPI 关系参数，将之导入Cytoscape 3.9.1 软件，应用“CytoNCA”插件筛选关键靶点，根据介数中心性（Betweenness Centrality）、接近中心性（Closeness Centrality）、度中心性（Degree Centrality）、特征向量中心性（Eigenvector Centrality）、局部平均连通性（Local Average Centrality）筛选出核心靶点基因。

1.5 基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 运用R 语言软件对芍药甘草汤合桃红四物汤活性成分与DPN 的共同靶点基因进行GO 功能富集分析与KEGG 通路富集分析。设置P＜0.05 为条件，筛选并输出富集分析结果排名靠前的10条GO生物功能和30条KEGG信号通路，并根据结果绘制柱状图、气泡图。

1.6 核心活性成分与核心靶点基因分子对接 以1.3 项及1.4项中筛选得到的核心活性成分与核心靶点基因分别作为配体、受体进行分子对接。首先通过Pubchem 数据库获取核心活性成分的小分子配体2D结构，再利用Chem3D 软件将之转换为3D 结构。在布鲁克海文蛋白质数据库（PDB）获取核心靶点基因蛋白受体的三维结构，并借助Pymol 软件进行去水分子及原配体操作。再通过AutoDockTools 软件将配体和受体转换为PDBQT 格式及确定活性口袋。最后通过AutoDock Vina 软件将小分子配体和蛋白受体进行分子对接，并将对接结果可视化。

2 研究结果

2.1 芍药甘草汤合桃红四物汤活性成分及靶点基因 从TCMSP 数据库中检索得到芍药甘草汤合桃红四物汤共有161 个活性成分，其中白芍13 个，甘草92个，熟地黄2个，当归2个，川芎7个，桃仁23个，红花22 个。将上述活性成分的靶点蛋白经Uniprot 数据库转换为靶点基因，共241个。

2.2 DPN 靶点获取 通过DrugBank、PharmGKB、GeneCards、OMIM、TTD数据库筛选获得与DPN相关的靶点基因共5 596 个（DrugBank 数据库116 个、PharmGKB 数据库225个、GeneCards数据库5 118个、OMIM 数据库135 个、TTD 数据库2 个），综合各数据库结果，去重后获得DPN 靶点基因共5 303 个，见图1。将DPN 的5 303 个靶点基因与芍药甘草汤合桃红四物汤的241 个靶点基因取交集，最终获得药物-疾病共同靶点基因184个，见图2。

图1 各数据库中DPN相关靶点基因的分布

图2 芍药甘草汤合桃红四物汤与DPN的共同靶点基因

2.3 芍药甘草汤合桃红四物汤活性成分-DPN 共同靶点基因网络 根据芍药甘草汤合桃红四物汤活性成分与DPN 的共同靶点基因，反向筛选得到作用于DPN 的相关活性成分125 个。通过Cytoscape 3.9.1 软件将芍药甘草汤合桃红四物汤活性成分-DPN 共同靶点基因网络可视化处理，见图3。活性成分-DPN 共同靶点基因网络图中共有309个节点，其中活性成分125 个，靶点基因184 个。图中央呈矩阵排列的圆圈代表DPN 潜在的治疗靶点基因，四周圆形排列的圆圈代表芍药甘草汤合桃红四物汤活性成分，不同颜色代表不同药物的活性成分，连线代表活性成分与靶点基因间的相互作用。以“Degree”为标准，将活性成分进行排序，排名前5 的核心活性成分为MOL000098（槲皮素）、MOL000006（木犀草素）、MOL000422（山奈酚）、MOL004328（柚皮素）、MOL003896（7-甲氧基-2-甲基异黄酮），作用靶点基因分别为111、45、42、29、27个，可推测这些活性成分可能是芍药甘草汤合桃红四物汤治疗DPN 的核心活性成分。

图3 芍药甘草汤合桃红四物汤活性成分-DPN共同靶点基因网络图

2.4 PPI 网络构建 将184 个共同靶点基因导入STRING 数据库平台构建PPI 网络图，并通过Cytoscape 3.9.1 软件将PPI 数据进行可视化分析，见图4。图中靶点基因以节点呈现，节点之间相互作用的关系以边表示。共有160 个节点和739 条边，Degree 值的大小与节点的大小、颜色深浅呈正相关。调整相关参数（Betweenness Centrality≥65.871 454 98；Closeness Centrality≥0.092 928 239 5；Degree Centrality≥7；Eigenvector Centrality≥0.040 539 527 5；Local Average Centrality≥2.291 666 666 5）保留大于中位值的靶点基因，对靶点基因进行筛选，得到48 个靶点基因。对这48 个靶点基因再次进行筛选，条件为：Betweenness Centrality≥18.852 097 12；Closeness Centrality≥0.546 511 628； Degree Centrality≥11； Eigenvector Centrality≥0.106 636 494 5；Local Average Centrality≥5.25，最终得到19 个靶点基因，分别是：细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A（CDKN1A）、信号传导及转录激活蛋白3（STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、白细胞介素-6（IL6）、原癌基因（FOS）、表皮生长因子受体（EGFR）、肿瘤坏死因子（TNF）、丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）、热休克蛋白90α 家族A 类成员1（HSP90AA1）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、细胞周期蛋白D1（CCND1）、雌激素受体1（ESR1）、核内癌基因（MYC）、缺氧诱导因子1 亚基α（HIF1A）、信号转导与转录激活因子1（STAT1）、肿瘤蛋白p53（TP53）、连环蛋白β1（CTNNB1）、V-rel网状内皮细胞病毒癌基因同源物A（RELA）。以“Degree”为标准，将以上19 个靶点基因进行排序，排名前5 的核心靶点基因为STAT3、 MAPK3、 HSP90AA1、MAPK1、RELA，筛选图见图5。

图4 芍药甘草汤合桃红四物汤与DPN共同靶点PPI网络图

图5 芍药甘草汤合桃红四物汤治疗DPN靶点基因相互作用网络分析及筛选图

2.5 GO 功能富集分析结果 利用R 语言软件对184个共同靶点基因进行GO 功能富集分析，富集结果包括生物进程（BP）、细胞组成（CC）、分子功能（MF），分别为2 595、127、218 个GO 条目，共2 940 个。BP主要涉及氧化应激反应，对活性氧的反应，对肽、脂多糖（LPS）的反应，对神经营养水平的反应等；CC主要涉及膜筏、囊泡腔、内质网腔、神经元细胞体；MF 主要涉及核受体活性、核类固醇受体活性、G 蛋白耦联受体（GPCRs）活性、转录辅激活因子结合等。取各组排名前10的GO条目绘制柱状图，见图6。

图6 GO功能富集分析柱状图

2.6 KEGG 通路富集分析结果 利用R 语言软件对184 个共同靶点基因进行KEGG 通路富集分析，共得到信号通路182条。包括脂质和动脉粥样硬化、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关的疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体（AGE-RAGE）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、白细胞介素-17（IL-17）信号通路、缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路等。富集分析结果提示上述信号通路可能为芍药甘草汤合桃红四物汤治疗DPN的关键通路。根据P值大小进行排序，取排在前30 条的KEGG信号通路绘制气泡图，见图7。

图7 KEGG通路富集分析气泡图

2.7 核心活性成分与核心靶点基因分子对接 选取核心靶点基因 STAT3、 MAPK3、 HSP90AA1、MAPK1、RELA 的蛋白受体与核心活性成分槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮的小分子配体进行分子对接，对接结合能数据见表1。对接结果显示，此5 种核心活性成分小分子配体与核心靶点基因蛋白受体的最低结合能均小于-5 kcal/mol，表明芍药甘草汤合桃红四物汤的核心活性成分与核心靶点基因有较好对接活性，结合能力较强。其中木犀草素与HSP90AA1 对接结合能最低，为-10.3 kcal/mol，提示结合活性最好。5 个核心活性成分与靶点基因HSP90AA1对接的结合情况见图8。

表1 核心活性成分与核心靶点基因的对接结合能 kcal/mol

图8 5种核心活性成分与靶点基因HSP90AA1对接示意图

3 讨论

3.1 芍药甘草汤合桃红四物汤与DPN DPN 可归属于中医学消渴痹证、消渴痿证等疾病范畴，属本虚标实之证。普遍认为DPN 的发病机制多因消渴日久，燥热伤阴耗气，致气阴两虚，气虚则无以推动血行，阴虚则生内热，虚火久蒸，损耗阴液，干血内结，导致血运迟缓，气血运行不畅，四肢筋脉失于气血温润濡养，不荣则痛；久病入络，脉络痹阻，不通则痛，出现肢体麻木、疼痛、感觉异常等症状[6]。阴虚燥热是发生DPN 的关键，瘀血是造成此病的重要原因，故应治以滋阴活血、柔筋缓急。

桃红四物汤出自《医宗金鉴》，由桃仁、红花、川芎、熟地黄、白芍、当归6味药组成，具有养血活血之功效。现代药理研究结果证实，桃红四物汤有降血脂、扩血管、抗疲劳、耐缺氧、补充微量元素、抗氧化损伤、抗炎、提高免疫力、神经保护等作用[7]。芍药甘草汤则出自《伤寒论》，由白芍、炙甘草2味药组成，具有滋阴养血、缓急止痛之功效。现代药理研究结果表明，白芍的有效成分芍药苷、芍药内酯苷、白芍总苷具有抗炎镇痛、抗氧化、降糖降脂、抗抑郁、保肝、调节免疫等药理作用[8]；炙甘草中黄酮类成分含量较高，具有抗炎、抗氧化、抗心律失常、调节免疫和抗菌等药理作用[9]。临床研究发现，芍药甘草汤可用于治疗痉挛性、疼痛性疾病，对缓解四肢平滑肌的挛急效果显著[10-11]。两方合用，奏滋阴活血、柔筋缓急之效，标本兼治。

3.2 芍药甘草汤合桃红四物汤治疗DPN 的核心活性成分及靶点基因 本研究结果提示，芍药甘草汤合桃红四物汤的125 个活性成分中，Degree 值排名前5 的是槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮。上述5 种核心活性成分皆为黄酮类化合物，由此可见，黄酮类化合物在DPN 的治疗中可能发挥着重要的作用。槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、心血管保护、神经保护、血糖调节等药理作用[12]；有研究发现，槲皮素可通过抑制炎症反应，减少神经细胞凋亡，促进神经传导，从而改善糖尿病大鼠的神经病理性疼痛，且在体内外可通过减轻线粒体损伤，对高血糖诱导的周围神经病变有神经保护作用[13-14]。木犀草素具有抗氧化、抗炎、改善胰岛素抵抗、保护神经的作用，能防止人单核细胞白血病细胞（THP-1）巨噬细胞焦亡，减轻线粒体损伤，抑制促炎细胞因子的释放，减少神经元凋亡，可抑制糖尿病并发症的发生、发展[15-16]。山奈酚具有抗氧化应激、抗炎、抑制细胞凋亡的作用，可通过减少晚期糖基化终末产物（AGEs）形成，增加β 细胞中胰岛素的产生和分泌，增强细胞对葡萄糖的摄取，促进骨骼肌葡萄糖代谢和抑制肝糖异生而降低血糖[17-18]。柚皮素具有抗氧化、抗炎、免疫调节、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、降血脂等广泛的生物活性[19]。有研究发现柚皮素可提高细胞活力，抑制细胞凋亡，缓解DPN，其作用机制可能是抑制核因子-κB（NF-κB）信号通路，缓解高糖损伤雪旺细胞过程中的炎症反应和氧化应激反应[20]。因此，芍药甘草汤合桃红四物汤的活性成分可能通过抗氧化应激、抗炎、调节血糖以及保护神经等作用，延缓DPN 病程进展，达到治疗的目的。

本研究所获得的核心程度最高的5个核心靶点基因为STAT3、MAPK3、HSP90AA1、MAPK1、RELA。作为STATs家族的一员，STAT3是连接癌症、免疫及炎症反应的关键信号分子，能够激活JAK 激酶/信号传导及转录激活蛋白（JAK/STAT）信号通路，与神经病理性疼痛的发生、发展有关[21-22]。MAPK1、MAPK3同属于MAPK家族，参与调控细胞的增殖、分化、凋亡及炎症反应等多种生理病理活动，与葡萄糖诱导的氧化应激所导致的神经元凋亡、神经元再生受损及神经病变密切相关[23]。HSP90AA1 是热休克家族的重要成员，可以调节血管内皮生长因子表达，是调节细胞增殖、凋亡的关键因子[24]，是DPN形成的重要分子之一。RELA 基因编码的转录因子p65 是NF-κB家族中的一个重要成员，可以通过调控细胞在免疫炎症反应中相关基因的表达水平，参与DPN 的发生、发展[25]。由此可见，上述核心靶点基因与炎症反应、细胞代谢、神经元功能的调节密切相关，而这些因素均可影响DNP 的发生、发展，故可为后续的实验验证提供方向及参考。

3.3 芍药甘草汤合桃红四物汤治疗DPN 可能的作用机制 本研究的GO 功能富集分析结果提示，芍药甘草汤合桃红四物汤治疗DPN 可能通过膜筏、囊泡腔、内质网腔、神经元细胞体等细胞结构，调节核受体活性、核类固醇受体活性、配体激活转录因子活性、GPCRs 活性、DNA 与转录因子结合等分子功能，影响氧化应激反应、对活性氧族的反应、对肽与LPS的反应、对营养水平的反应、细胞对化学应激的反应、对细胞外刺激的反应等生物进程。其中，高血糖引发的氧化应激反应可激活多元醇通路、己糖胺途径、AGEs 形成，引发和放大神经炎症，导致线粒体功能障碍，神经元及周围神经胶质细胞损伤、凋亡[26]。此外，氧化应激所产生的过量活性氧在神经毒性方面亦起着重要作用[27]。有研究发现，维生素和抗氧化补充剂可显著提高DPN 患者腓肠神经、正中神经的神经传导速度，改善临床症状，延缓DPN 的进展[28]。LPS来自革兰氏阴性肠道菌群，可合成和释放多种细胞因子和炎性介质。有研究发现，高脂肪饮食喂养的小鼠，其血浆LPS 的循环浓度增加、体质量增加、空腹血糖升高，发生炎症，诱导了代谢性疾病的发生，这与在正常饮食喂养的小鼠中注射LPS引起的代谢反应在一定程度上相似，其机制可能是LPS/CD14系统设置了高脂肪饮食诱导代谢性疾病发生的阈值[29]。神经营养支持的水平与DPN 的发病关联密切，神经功能障碍和神经血液灌注减少，可导致神经营养不良，最终导致神经损伤[30]。神经营养因子包括神经生长因子、脑源性神经营养因子等，可减轻神经元损伤程度，促进神经纤维的生长和周围神经的恢复，在周围神经中发挥重要的神经保护作用[31]。GPCRs 可通过与糖、蛋白质、脂质等配体结合并发生结构改变，激活细胞内的信号通路[32-33]，是治疗糖尿病及其并发症的新型药物靶点之一。细胞对化学应激、细胞外刺激的反应，可激活丝裂原活化蛋白激酶和多种磷脂酶，增强细胞对应激原的抵抗力，拮抗细胞凋亡及激活炎症细胞[34]。

本研究的KEGG通路富集分析结果显示，芍药甘草汤合桃红四物汤干预DPN 的信号通路主要涉及脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、PI3K-Akt 信号通路、AGE-RAGE 信号通路、IL-17信号通路、TNF 信号通路、HIF-1 信号通路等。PI3K-Akt 通路能够通过调节雪旺细胞促进髓鞘形成、修复神经纤维，改善高糖环境下的细胞氧化应激水平[35]，对DPN 的治疗有重要意义。长期高血糖导致AGEs 在周围神经组织蓄积过多，与AGEs 受体（RAGE）结合后激活AGE-RAGE 信号通路，导致促炎细胞因子释放增加、激活氧化应激反应，造成神经损伤[36-37]，加速DPN 的发生、发展。IL-17 是重要的促炎症细胞，参与炎症和自身免疫性疾病的调控[38]。有研究发现，IL-17 信号通路可通过影响棕色和米色脂肪组织的产热作用促进产热和能量消耗，抑制肥胖和胰岛素抵抗的发展[39]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是TNF 信号通路中具有代表性的炎症因子，不仅对神经元及神经胶质细胞具有毒性作用，还会加重血管内皮细胞的炎症反应，导致内皮细胞的损伤[40]。有研究发现，DPN 患者的TNF-α 水平升高，与正中神经、腓神经的神经传导速度呈负相关，提示TNF-α 可能是DPN 患者神经传导异常的影响因素[41]。HIF-1α 是HIF-1 的亚单位，是应答缺氧应激的关键转录因子[42]。有研究发现，HIF-1α 可通过促进新血管生成、扩张血管，进而改善糖尿病周围神经组织缺血缺氧，起到保护神经的作用[43]。笔者认为，芍药甘草汤合桃红四物汤可能通过调控上述信号通路来改善胰岛素抵抗、抗氧化应激、抑制炎症反应、保护神经细胞，达到治疗DPN的目的。

分子对接结果显示，芍药甘草汤合桃红四物汤的5 个核心药物活性成分槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮与核心靶点基 因 STAT3、 MAPK3、 HSP90AA1、 MAPK1、RELA 均有较好对接活性，结合能力较强，其中木犀草素与HSP90AA1 结合作用最好，验证了芍药甘草汤合桃红四物汤的核心活性成分与DPN 核心靶点基因有较好的亲和力。在今后的基础试验中可探究这些活性成分对DPN 的作用机制，为临床治疗提供思路。

综上所述，通过运用网络药理学方法及分子对接技术，本研究发现芍药甘草汤合桃红四物汤中的黄酮类主要活性成分槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮可能是治疗DPN 的主要成分。芍药甘草汤合桃红四物汤治疗DPN 以STAT3、MAPK3、HSP90AA1、MAPK1、RELA 等为核心靶点基因，涉及氧化应激反应、细胞对化学应激的反应、对肽与LPS的反应、对神经营养水平的反应、对活性氧的反应等多个生物过程，并通过调控PI3K-Akt 信号通路、AGE-RAGE 信号通路、IL-17信号通路、TNF 信号通路、HIF-1 信号通路等关键信号通路起治疗作用。在后续研究中，可对芍药甘草汤合桃红四物汤的活性成分进行鉴别，并对筛选出的核心靶点基因及通路进行验证，为临床应用奠定基础。