基于网络药理学与分子对接技术探究炙甘草汤抗心肌缺血再灌注损伤的作用机制
2024-04-29任海云蔚蓁
任海云 蔚蓁
摘要 目的：运用网络药理学方法和分子对接技术探讨炙甘草汤减轻心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的作用机制。方法：利用中医药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）与中药分子机制生物信息学分析工具（BATMAN-TCM）获取炙甘草汤有效成分并预测其作用靶点，然后应用人类基因综合（GeneCards）与人类疾病相关基因和突变信息的综合平台（DisGeNET）数据库预测MIRI靶点，通过Venny在线绘图软件获取炙甘草汤抗MIRI潜在作用靶点。利用蛋白质相互作用分析数据库（STRING数据库）平台构建蛋白互作（PPI）网络，并通过Cytoscope 3.9.1软件可视化、筛选出核心靶点，利用Metascape 基因功能分析平台对筛选出的核心靶点进行基因本体（GO）富集分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，探究炙甘草汤抗MIRI机制，再次利用Cytoscape 3.9.1软件构建活性成分-疾病-核心靶点-通路网络。最后利用分子对接程序AutoDock vina对炙甘草汤主要活性成分与其核心靶点结合活性进行验证。结果：经筛选获得炙甘草汤147个活性成分、865个基因靶点，MIRI 144个靶标，通过Venny数据库获取炙甘草汤抗MIRI潜在作用靶点79个；经PPI网络分析并筛选出40个关键靶点，其中肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）、蛋白激酶B（AKT1）、血管内皮生长因子 A（VEGFA）、一氧化氮合酶3（NOS3）、过氧化氢酶（CAT）、CC趋化因子配体 2（CCL2）、髓过氧化物酶（MPO）均与炎症反应或氧化应激有关。经GO富集分析发现氧化应激、炎症反应与此生物学过程密切相关；经KEGG分析探究炙甘草汤抗MIRI的通路，共映射出178条信号通路。将炙甘草汤活性成分-疾病-核心靶点-通路网络中排名居前3位的成分及其关键靶点进行验证，结果显示炙甘草汤主要活性成分与关键作用靶点结合活性很强，能形成稳定的化合物。结论：甘草查尔酮A、人参皂苷Rh2、6-醛基异麦冬黄酮B、山柰酚、芒柄花黄素、麦冬皂苷C等为炙甘草汤抗MIRI的主要成分，通过TNF、IL-6、AKT1、VEGFA、NOS3、CAT、CCL2、MPO等核心靶点调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、TNF、Toll样受体-4（TLR4）、缺氧诱导因子-1（HIF-1）、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、转化生长因子-β（TGF-β）、核转录因子-κB（NF-κB）等信号通路，减轻改善MIRI，体现出炙甘草汤多成分-多靶点-多途径的作用优势，为进一步深入动物学实验与临床试验提供了数据与理论支持。
关键词 心肌缺血再灌注损伤；炙甘草汤；网络药理学；分子对接；作用机制
doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.03.003
The Mechanism of Anti-myocardial Ischemia-reperfusion Injury of Honey-fried Licorice Decoction Based on Network Pharmacology and Molecular Docking
REN Haiyun， WEI Zhen
College of Traditional Chinese Medicine and Food Engineering， Shanxi University of Chinese Medicine， Jinzhong 030619， Shanxi， China， E-mail： renhy1119@sxtcm.edu.cn
Abstract Objective：To explore the mechanism of action of Honey-fried Licorice Decoction on myocardial ischemia/reperfusion injury（MIRI） based on network pharmacology and molecular docking.Methods：The active components of Honey-fried Licorice Decoction were obtained and its target was predicted by the Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） and the Traditional Chinese Medicine Molecular mechanism bioinformatics analysis tool（BATMAN-TCM）.The target of MIRI was predicted by the integrated platform of human Gene Synthesis（GeneCards） and human disease-related gene and mutation information（DisGeNET） database，and the potential target of Honey-fried Licorice Decoction anti-MIRI was obtained by Venny online software.The protein interaction（PPI） network was constructed using the Protein Interaction Analysis Database（String database） platform，and the core targets were screened and visualized by Cytoscope 3.9.1 software.The anti-MIRi mechanism of Honey-fried Licorice Decoction was investigated by Gene ontology（GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） signaling pathway enrichment analysis for the selected core targets by Metascape gene function analysis platform.The molecular docking program AutoDock vina was used to verify the binding activity of the main active ingredients of Honey-fried Licorice Decoction and its core target.Results：After screening，147 active ingredients，865 gene targets，and 144 MIRI targets of Honey-fried Licorice Decoction were selected.Seventy-nine potential anti-MIRI targets were obtained through Venny database.Forty core targets were screened by PPI network analysis，which showed that tumor necrosis factor（TNF），interleukin-6（IL-6），protein kinase B-α（AKT1），vascular endothelial growth factor A（VEGFA），endothelial nitric oxide synthetase（NOS3），catalase（CAT），CC chemokine ligand 2（CCL2），and myeloperoxidase（MPO） were related to inflammatory response or oxidative stress.GO enrichment analysis showed that oxidative stress and inflammation were closely related to this biological process.The anti-MIRI pathways of Honey-fried Licorice Decoction were explored by KEGG analysis，and 178 signal pathways were mapped.The top 3 components and their key targets in the active ingredient-disease-core target-pathway network of Honey-fried Licorice Decoction were verified.The results showed that the main active components of Honey-fried Licorice Decoction showed strong binding activity with the key targets to form stable compounds.Conclusion：Glycyrrhizin A，ginsenoside Rh2，6-aldehyde isophiopogon flavonoid B，kaempferol，ononcetin，and ophiopogon saponin C were the main anti-MIRI components of Honey-fried Licorice Decoction.Mitogen-activated protein kinases（MAPKs），TNF，Toll-like receptors，hypoxia-inducing factor-1（HIF-1），and phosphatidylinosito-3 kinase/protein kinase B（PI3K/AKT） were regulated through core targets such as TNF，IL-6，AKT1，VEGFA，NOS3，CAT，CCL2，and mammalian target of rapamycin（mTOR），transforming growth factor-β（TGF-β），nuclear transcription factor-κB（NF-κB），and other signaling pathways to alleviate and improve MIRI，reflecting the advantages of Honey-fried Licorice Decoction′s multi-component，multi-target，multi-pathway action，which would provide data and theoretical support for further zoological experiments and clinical trials.
Keywords myocardial ischemia-reperfusion injury; Honey-fried Licorice Decoction; network pharmacology; molecular docking; mechanism
基金项目 山西省基础（自由探索类）研究项目（No.202203021221203）；山西省重点实验室项目（No.04010910029）；山西中医药大学博士科研启动基金（No.2020BK03）
作者单位 山西中医药大学中药与食品工程学院（山西晋中 030619），E-mail：renhy1119@sxtcm.edu.cn
引用信息 任海云，蔚蓁.基于网络药理学与分子对接技术探究炙甘草汤抗心肌缺血再灌注损伤的作用机制［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（3）：402-409.
急性心肌梗死是目前致死和致残率极高的病理变化。国内临床主要采用经皮冠状动脉介入或溶栓治疗及时恢复冠状动脉血流［1］，再灌注损伤严重影响病人预后。如何在恢复冠状动脉血流的同时减少再灌注损伤已成为心肌梗死治疗的重点。中药在我国资源丰富，具有多成分、多靶点、多通道的作用优势，从中寻找改善心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的理想方案成为近几年国内外研究焦点。炙甘草汤是治疗“脉结代，心动悸”的经典名方。据文献记载炙甘草汤对缺血再灌等原因所致的心律失常有明显防治作用［2-6］。然而，炙甘草汤抗MIRI作用机制尚未明确。因此，深入研究炙甘草汤抗MIRI的主要药效物质及作用机制具有重要意义。基于网络药理学和分子对接技术，本研究构建炙甘草汤成分、MIRI、靶点及信号通路的互作网络，系统探索炙甘草汤改善MIRI的作用机制。
1 资料与方法
1.1 中药有效成分及其作用靶点的收集与筛选
将炙甘草汤中人参、甘草、大枣、生姜、火麻仁、桂枝这六味药，基于中医药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）［7］检索有效成分及作用靶点，设置口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18。另外，麦冬、地黄、阿胶三味药则选择中药分子机制生物信息学分析工具BATMAN-TCM［8］（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）获取其有效化学成分及相应基因靶点，以可靠性＞20%及P＜0.05为条件筛选。检测发现这两种数据库中查询所得的基因靶点名称不一致，因此，通过蛋白质数据库UniProt（https：//www.uniprot.org/）限定Human 物种，检索并验证靶点，然后转化为标准基因名称。
1.2 疾病靶点的收集与筛选
借助人类基因综合GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）与人类疾病相关基因和突变信息的综合平台（DisGeNET，https：//www.disgenet.org/home/）数据库，输入“myocardial reperfusion injury”检索MIRI作用靶点，基于相关评分，整合并去重，选择与MIRI密切相关的靶点作为研究对象。
1.3 中药成分与疾病靶点交互网络的构建
利用在线Venny绘图软件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）将炙甘草汤活性成分与MIRI作用靶点分别导入其中，获取炙甘草汤活性成分抗MIRI潜在作用靶点，并绘制韦恩图。
1.4 炙甘草汤抗MIRI蛋白互作（PPI）网络构建与分析筛选
通过蛋白质相互作用分析STRING数据库（https：//string-db.org/）［9］创建PPI网络。将获取的炙甘草汤活性成分抗MIRI潜在作用靶点导入SRING数据库，限定Homo sapiens物种，中等置信度，获得炙甘草汤活性成分抗MIRI靶点的PPI网络。将PPI网络导入Cytoscope 3.9.1软件中，并采用插件Analyze network分析PPI网络，基于度值（Degree值）大小（Degree值≥中位数）过滤出核心作用靶点。
1.5 核心靶点的生物功能及通路富集分析
将筛选出的炙甘草汤活性成分抗MIRI核心靶点通过Metascape基因功能分析平台（https：//metascape.org/gp/index.html）［10］，限定物种H.sapiens，在Custom analysis模式下，设置Min Overlap≥3，P Value Cut off≥0.01，进行基因本体（GO）富集分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，并将其结果进行可视化。
1.6 活性成分-疾病-核心靶点-通路网络的构建
将筛选出的炙甘草汤成分抗MIRI核心靶点分别与炙甘草汤活性成分、MIRI及其关键通路进行对应，将得到的文件导入Cytoscope 3.9.1软件中构建活性成分-疾病-核心靶点-通路网络。
1.7 分子对接
首先，利用TCMSP数据库下载筛选出Degree值排名居前3位的中药核心成分结构式（mol2格式）。其次，通过PDB蛋白质数据库获取核心靶点的3D蛋白结构（pdb格式），用Pymol软件消去其溶剂分子和配体等，并保存其蛋白受体三维结构，再用AutoDock软件对其加氢及加电子等操作。最后利用AutoDock vina程序对核心靶蛋白与中药核心成分做分子对接验证，并通过Pymol可视化。
2 结 果
2.1 炙甘草汤活性成分及预测靶点
在TCMSP数据库中获得人参、甘草、大枣、生姜、火麻仁、桂枝的活性成分共161个，对应2 716个靶点。在BATMAN-TCM数据库中得到麦冬、地黄、阿胶的活性成分共43个，对应930个靶点。详见图1。合并结果得到炙甘草汤活性成分共184个、靶点3 691个。去重得到147个活性成分、943个靶点。将得到的预测靶点导入UniProt数据库中，以Human 为限定物种基因进行验证，并将其名称转化为Gene symbol，最终得到基因靶点865个。详见表1。
2.2 MIRI靶点的获取筛选
借助GeneCards数据库与DisGeNET数据库对数据进行整理分析得到1 027个与MIRI有关的靶点基因，以与MIRI相关度≥20为筛选条件，整合去重，筛选出144个疾病靶点。取炙甘草汤活性成分作用靶点与MIRI作用靶点绘制韦恩图，获取炙甘草汤活性成分抗MIRI潜在作用靶点79个。详见图2。
2.3 PPI网络的构建与分析
将79个炙甘草汤活性成分抗MIRI潜在作用靶点导入STRING数据库进一步评估其表达特性，以Homo sapiens为限定物种，中等置信度＞0.4为条件，获取到炙甘草汤成分靶点79个节点、2 876条边的PPI网络，这79个节点Degree值均大于4。详见图3。节点表示基因靶点，节点越大颜色越深，说明其在炙甘草汤抗MIRI方面发挥着越关键的调控作用。以Degree值≥中位数为筛选条件获得40个核心作用靶点。详见表2。
2.4 炙甘草汤抗MIRI核心靶点富集分析
利用Metascape网站，对炙甘草汤抗MIRI的40个核心靶点进行富集分析，依据P＜0.01筛选标准共得到GO富集分析功能条目1 171条，涉及1 099个生物过程（BP），22个细胞组分（CC）、50个分子功能（MF）。主要包括细胞迁移的正向调控、细胞运动的正调控、对氧化应激的反应、细胞组分运动的正向调控、对活性氧物种的反应等；CC主要包括膜筏、膜微结构域、细胞质膜微囊、转录调节复合物、质膜筏等；MF主要包括受体配体活性、信号受体激活活性、信号受体调节活性、抗氧化活性等。P值越小，富集程度越高，对炙甘草汤抗MIRI影响越显著。以P＜0.01的筛选标准分别选出BP、CC、MF中影响显著性居前10位靶点进行可视化分析。详见图4。
KEGG信号通路富集分析共映射出178条信号通路，以P＜0.01为筛选条件，根据P值大小选取居前20条进行可视化展示。详见图5。气泡越大，颜色越红，代表P值越小，该信号通路在炙甘草汤抗MIRI机制中发挥越关键作用，影响越显著。主要涉及的信号通路包括脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的糖基化终产物-受体（AGE-RAGE）信号通路、癌症相关通路、肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素（IL）-17信号通路、查加斯病、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路，并与非酒精性脂肪肝、乙型肝炎、百日咳、弓形体病、疟疾、松弛素信号通路、内分泌的阻力、利什曼病、麻疹、肺结核、沙门氏菌感染等通路有相关性。以上分析结果显示炙甘草汤活性成分靶点分布于不同路径，主要通过多通路协同抗MIRI。
2.5 炙甘草汤抗MIRI活性成分-疾病-核心靶点-通路网络的构建
运用Cytoscape 3.9.1，将炙甘草汤活性成分抗MIRI中的多成分-多靶点-多通路的作用特点更直观地展示在活性成分-疾病-核心靶点-通路网络图中。图中红色倒三角为影响最显著的前20条作用通路，紫色菱形为基因靶点，绿色三角形为炙甘草汤活性成分，黄色圆形为疾病即MIRI。详见图6。利用软件插件 Network Analyzer 计算网络参数，得到的Degree值越大，节点越大，在活性成分-疾病--核心靶点-通路网络图中其影响越显著，Degree值为1的则舍弃。其中丝裂原激活化蛋白激酶8（MAPK8）、原癌基因蛋白/活化蛋白1抗体（JUN）、原癌基因（FOS）、肿瘤坏死因子（TNF）、胱天蛋白酶3抑制剂（CASP3）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、Toll样受体-4（TLR4）、CXC趋化因子配体8（CXCL-8）、干扰素基因（IFNG）均为抗MIRI的关键靶点。炙甘草汤活性成分通过关键靶点调控相关信号通路改善MIRI。
2.6 炙甘草汤活性成分与核心作用靶点的分子对接验证
利用分子对接技术，将活性成分-疾病-核心靶点-通路网络中连接度排名居前3位的炙甘草汤活性成分甘草查尔酮A、人参皂苷Rh2、6-醛基异麦冬黄酮B分别与其作用的关键靶点TNF、MPO、IL6、CC趋化因子受体2（CCL2）进行验证。据文献报道，对接结合能≤－20.92 kJ/mol时，中药成分作为配体与蛋白受体结合具有良好活性；当对接结合能≤－29.29 kJ/mol时，中药成分作为配体与蛋白受体结合具有较强活性［11-12］。甘草查尔酮A与关键靶点结合形成的复合物中，与TNF结合能（－30.17 kJ/mol）最小且小于－29.29 kJ/mol，说明甘草查尔酮A与TNF具有更强的结合活性。甘草查尔酮A通过与蛋白氨基酸LEU-263、ASP-264、ASP-260、LEU-259、GLY-256、TNF形成多个氢键，由此也可以证明其较强的结合活性。甘草查尔酮A与MPO也具有较强的结合活性，也能形成较为稳定的复合物。此外，通过比较发现，6-醛基异麦冬黄酮B与CCL2结合能更强，而人参皂苷Rh2则与关键靶点IL6结合能更强，均可形成较为稳定的复合物。详见图7及表3。
3 讨 论
基于网络药理学与分子对接技术，探究炙甘草汤抗MIRI作用机制，本研究发现炙甘草汤共有147个活性成分、865个潜在靶点可能与抗MIRI相关，其中人参皂苷Rh2、山柰酚、芒柄花黄素、甘草查尔酮A、麦冬皂苷C、6-醛基异麦冬黄酮B等为炙甘草汤抗MIRI的主要活性成分。人参皂苷Rh2是人参关键活性成分，能明显抑制肿瘤、改善免疫功能以及减轻心肌缺血损伤。现有文献证明人参皂苷Rh2通过抑制NLRP3、IL-1β、TNF-α炎性相关因子表达，提高超氧化物歧化酶（SOD）活性可以实现对缺血再灌注心肌的保护作用［13］。山柰酚作为人参与甘草的共有成分属于黄酮类化合物，可以显著降低心肌细胞过氧化氢所致的乳酸脱氢酶（LDH）释放，具有很好的抗氧化损伤能力，能明显减轻缺氧复氧对心肌细胞的损伤［14］。芒柄花黄素是炙甘草的主要成分之一，为黄酮类化合物，通过抑制氧化、炎症和凋亡，促进自噬，保护心肌细胞，能明显降低心肌细胞内丙二醛（MDA）、LDH和肌酸激酶（CK）的含量，通过自噬增强改善缺血再灌注诱发的衰老细胞凋亡的问题，最终达到加强保护心肌细胞的目的［15］。甘草查尔酮 A是甘草主要活性成分，属新型黄酮类物质，能通过抗病毒、抗氧化、抗炎等作用，有效防治心血管疾病。据文献报道甘草查尔酮A可通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）/ 核因子E2相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶-1（HO-1）通路，减缓线粒体的氧化应激，有效改善H2O2诱发的心肌细胞损伤［16］。麦冬皂苷C是麦冬的活性成分，属甾体皂苷，可显著降低心肌缺氧小鼠垂体后叶激素引起的T波变化及小鼠血清中LDH、CK活性，可有效抑制心肌缺血引起的MDA含量升高，明显保护心肌细胞缺氧复氧损伤，从而使其寿命得到显著性延长［17］。6-醛基异麦冬黄酮B属于高异黄酮类化合物，亦为麦冬活性成分，可以通过多通路对心肌形成保护作用，具有抗炎、抗肿瘤以及抗氧化等多方面的功效［18］。
综上所述，炙甘草汤中主要活性成分人参皂苷Rh2、山柰酚、芒柄花黄素、甘草查尔酮A、麦冬皂苷C、6-醛基异麦冬黄酮B等能综合调节核心靶点抑制氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等，改善MIRI。
经蛋白互作PPI网络分析，共筛选出40个核心作用靶点，其中TNF、IL6、CCL2、VEGFA、NOS3、CAT、MPO、SOD2、NOS2均与炎症反应或氧化反应有关［19］。结合分子对接验证结果，本研究发现甘草查尔酮A与关键靶点TNF、MPO均能结合形成稳定性较强的复合物。人参皂苷Rh2与6-醛基异麦冬黄酮B与关键靶点IL6、CCL2也能形成较为稳定的复合物。推测炙甘草汤可能通过这些靶点抑制炎症或氧化应激反应，从而发挥抗MIRI作用。据文献调研，在MIRI早期，大量活性氧的产生与炎症介质的释放很可能会促发体内氧化应激加剧MIRI［20］。TNF、IL6为关键炎性因子，可诱导心肌细胞CD11b/CD18表达黏附因子和中性粒细胞损伤心肌［21］。在心肌内SOD和过氧化氢酶（CAT）为关键的抗氧化酶，属于天然的活性氧清除剂，其中SOD可以将氧自由基·O2-转化成较低活性的H2O2，然后在CAT的催化作用下进一步分解成H2O2与O2，从而使心肌组织与血脂质氧化反应减弱，在一定程度上减轻了再灌注损伤。SOD、CAT在MIRI中还起到了减轻心肌缺血的作用［22］。有研究发现缺乏CCL2可有效降低小鼠MIRI引发的氧化应激，梗死面积明显回缩［23］。MPO作为溶酶体酶存在于中性粒细胞等细胞中，可诱发炎症、血管炎和动脉粥样硬化等疾病，在炎症部位其可催化H2O2生成活性氧，而活性氧水平超出机体氧化防御范围时，则会诱发氧化应激导致组织损伤［24］。有研究证明MPO水平的升高明显增加了心血管发病风险［25］。因此有效的抗炎、抗氧化应激有利于减轻缓解MIRI，并具有很重要的临床价值。
根据GO和KEGG富集分析结果显示，炙甘草汤通过膜筏、膜微结构域、细胞质膜微囊、转录调节复合物、质膜筏等细胞组成，经过正向调控细胞迁移、细胞运动、细胞组分运动、对氧化应激的反应以及对活性氧物种的反应等生物过程，发挥受体配体活性、信号受体激活活性、信号受体调节活性、抗氧化活性、蛋白质均二聚活性等分子功能，再通过调控 MAPKs 、TNF、Toll样受体-4、HIF-1、PI3K-AKT、mTOR、TGF-β、NF-κB等信号通路等，减轻改善MIRI。NF-κB在炎症早期发挥着核心作用［26］，MAPKs转导途径通过激活 NF-κB，造成NF-κB核转位转移到核内调节炎症介质，促进下游炎性因子表达［27］。
4 小 结
本研究基于网络药理学从炙甘草汤的活性成分、抗疾病关键作用靶点以及重要调控通路入手，探讨炙甘草汤抗MIRI作用机制，并利用分子对接技术验证炙甘草汤主要活性成分与相应关键蛋白的结合情况，揭示了其多成分、多靶点、多通路协同作用优势。研究还发现减轻炎症、氧化应激对心肌细胞的损害作用对治疗MIRI非常关键。这些发现为深入研究炙甘草汤抗MIRI作用机制提供了理论依据。由此筛选出来的核心靶点与调控通路将有待于进一步的体内外实验验证，为炙甘草汤的临床应用提供数据与理论支持。
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（收稿日期：2022-09-16）
（本文编辑 王雅洁）
