基于薄层色谱与一测多评法的沙棘颗粒质量评价方法研究△

樊修和，唐志书，2*，宋忠兴，王昌利，王珂

1.陕西中医药大学 陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心，陕西 咸阳 712046；2.中国中医科学院，北京 100700；3.陕西海天制药有限公司，陕西 咸阳 712000

沙棘颗粒是由沙棘加工处理后制成的颗粒剂，具有止咳化痰、消食化滞、活血散瘀功效。沙棘是胡颓子科植物沙棘Hippophae rhamnoidesL.的干燥成熟果实，具有健脾消食、止咳祛痰、活血散瘀功效，含有多种营养物质和人体所需的氨基酸[1]。其主要活性成分是黄酮类化合物，多为以异鼠李素、槲皮素、山柰素为母核的黄酮苷元及苷。现代研究表明，沙棘黄酮类化合物通过增加血管柔韧性和可塑性、改善心肌舒张功能、抑制血小板凝聚、改善微循环等发挥药理作用[2-3]。

对沙棘颗粒进行总黄酮及单一黄酮类成分的含量测定、薄层鉴别研究已有报道[4-6]，但由于成分具有复杂性，仅对单一成分进行检测难以全面评价药物质量。一测多评法（QAMS）可对多成分进行同时测定，并能够降低成本，快速实用[7-10]。本研究优化、完善了沙棘颗粒的薄层鉴别方法，建立了黄酮类成分的QAMS，可为该制剂的质量标准提升提供参考。

1 材料

1.1 仪器

e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；WFH-201BJ 型紫外-可见透射反射仪（上海精科实业有限公司）；TH-Ⅱ型薄层加热器（上海科哲生化科技公司）；CPA225D 型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 试药与耗材

对照品槲皮素（批号：100081-201610）、山柰素（批号：110861-201310）、异鼠李素（批号：110860-201611）纯度均≥98%，沙棘对照药材（批号：121519-201302）均购于中国食品药品检定研究院；色谱纯乙腈（美国Honeywell 公司）；色谱纯磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯；硅胶G板（批号：20211111，青岛海洋化工有限公司）。

沙棘颗粒样品由内蒙古海天制药有限公司生产（批号分别为200901、200902、200903、200904、200905、200906、201001、201002、201003、201004、201005、201101、201102、201103、201104），规格为15 g/袋。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 对照品溶液和对照药材溶液的制备 取山柰素、异鼠李素、槲皮素对照品适量，加甲醇制成质量浓度为1 mg·mL-1的混合对照品溶液。

按《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版沙棘药材鉴别项下方法[11]制备沙棘对照药材溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品2.0 g，加石油醚20 mL，浸泡12 h，回流1 h 脱脂，挥去石油醚，加70%乙醇50 mL 加热回流1 h，趁热滤过，滤液水浴蒸干，残渣加水25 mL 使溶解，加盐酸3.5 mL，水浴加热水解30 min，立即冷却，乙酸乙酯振摇提取2 次，每次20 mL，合并上层液，水洗2 次，每次15 mL，蒸干乙酸乙酯，残渣加甲醇2 mL 溶解，备用。

2.1.3 色谱条件 吸取供试品溶液3 µL、对照品溶液1 µL、对照药材溶液4 µL，分别点于同一含3%乙酸钠溶液的硅胶G 板，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸（10∶8∶1）为展开剂，展开后取出，晾干，喷以1%的三氧化铝无水乙醇溶液，置紫外光灯（365 nm）下检视。

2.1.4 鉴别结果 采用2.1.3 项下方法对15 批沙棘颗粒进行薄层鉴别，结果见图1。在与对照品和对照药材相应的位置上，15 批沙棘颗粒供试品均显相同颜色的荧光斑点。

图1 15批沙棘颗粒薄层色谱图

2.2 QAMS含量测定

2.2.1 色谱条件 Welch Ultimate® XB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～1 min，5%～7%B；1～5 min，7%～28%B；5～23 min，28%～32%B；23～33 min，32%～44%B；33～37 min，44%～95%B）；流速为1.0 mL·min-1；柱温为35 ℃；检测波长为365 nm；进样量为10 µL。

2.2.2 对照品溶液的制备 分别取槲皮素、山柰素和异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇定容，制得质量浓度分别为14.67、16.67、13.33 µg·mL-1的混合对照品溶液（以纯度为98%计算）。

2.2.3 供试品溶液的制备 取研细的沙棘颗粒约3.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸（1.6 mol·L-1）-甲醇（1∶4）50 mL，称定质量并于80 ℃加热回流150 min，立即冷却后再称定质量，补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液25 mL 置于50 mL 量瓶中，加80% 甲醇至刻度，摇匀，0.22 µm 滤膜滤过，取续滤液，备用。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 专属性试验 分别取混合对照品溶液和供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件分别进样10 µL，记录色谱图（图2）。供试品色谱图中待测成分呈与对照品一致的色谱峰，与相邻峰的分离度均大于1.5，表明该方法专属性良好，可用于沙棘颗粒中3个成分的含量测定。

图2 混合对照品溶液和沙棘颗粒供试品溶液的高效液相色谱图

2.2.4.2 线性关系考察 精密吸取2.2.2 项下混合对照品溶液，用80%甲醇逐级稀释，摇匀，制得系列质量浓度的混合对照品溶液。按2.2.1 项下色谱条件进样分析，以对照品质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），计算得回归方程及r，结果见表1。

表1 沙棘颗粒中3个成分的线性关系考察结果

2.2.4.3 精密度试验 精密吸取2.2.2 项下的混合对照品溶液，连续进样6 次，记录色谱图，槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的RSD 分别为0.23%、0.90%、0.33%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.4 稳定性试验 取沙棘颗粒（批号：190101），按2.2.3项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样分析，记录色谱图，槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的RSD分别为0.71%、1.02%、0.51%，表明24 h内样品稳定性良好。

2.2.4.5 重复性试验 取沙棘颗粒（批号：190101），精密称定6 份，按2.2.3 项下方法制备供试品溶液，进样测定并记录色谱图，得槲皮素、山柰素、异鼠李素含量的RSD 分别为2.01%、2.99%、2.70%，表明该方法重复性良好。

2.2.5 QAMS的建立

2.2.5.1 相对校正因子（f）的计算 取2.2.4.2项下系列混合对照品溶液，进样测定，以槲皮素为内参物，按公式（1）计算f。

式中，As为内参物峰面积；Cs为内参物质量浓度；Ai为待测成分峰面积；Ci为待测成分质量浓度。

山柰素和异鼠李素的f分别为1.57、0.92，RSD分别为2.18%、2.11%。

2.2.5.2 耐用性考察 取2.2.4.2 项下混合对照品溶液，进样测定，考察不同色谱仪（Agilent 1260 及Waters e2695）、不同色谱柱[Welch Ultimate® XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、岛津Inertsil ODS-SP（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]对各成分f的影响，见表2。采用Waters e2695色谱仪、Welch Ultimate® XB-C18色谱柱考察不同流速和柱温对各成分f的影响，结果见表3、表4。不同仪器、色谱柱、流速和柱温对f影响较小，表明该方法耐用性较好。

表2 不同色谱仪和色谱柱考察沙棘颗粒2个待测成分的f

表3 不同流动相流速考察沙棘颗粒2个待测成分的f

表4 不同柱温考察沙棘颗粒2个待测成分的f

2.2.5.3 色谱峰的定位 对2.2.5.2 项下仪器和色谱柱的相对保留时间进行考察以定位色谱峰，结果见表5，待测成分相对保留时间的RSD 均小于3%。

表5 不同色谱仪、色谱柱沙棘颗粒2个待测成分的相对保留时间

2.2.5.4 QAMS与外标法（ESM）比较 取15 批沙棘颗粒样品，按2.2.3 项下方法制备供试品溶液，测定。采用ESM 和QAMS 对样品中3 个成分含量进行测定，采用SPSS 21.0软件对2组结果进行Pearson相关性分析，2 种方法的r均为1.000，计算的含量具有较高相关性（P＜0.01），结果见表6。按公式（2）计算相对误差，以相对误差表示2种方法测得的结果差异。

表6 ESM与QAMS测定沙棘颗粒中各成分含量mg/袋

式中，W1为QAMS 所测含量；W2为ESM 所测含量。

结果发现，2 种方法测得的组分含量一致性好，相对误差均小于3%，表明建立的QAMS 可用于沙棘颗粒含量测定。

2.2.5.5 沙棘颗粒质量控制标准分析 采用Graph-Pad Prism 8.0.1 软件对15 批样品的3 个成分含量数据进行分析，如图3 所示，山柰素含量批间差异较小，含量为0.104 9～0.156 3 mg/袋；槲皮素含量（0.129 1～0.208 7 mg/袋）和异鼠李素含量（0.317 4～0.675 3 mg/袋）批间差异较大。通过对批间3 个成分的对比分析，建议取各成分最小含量值的80%作为标准，即将沙棘颗粒含槲皮素、山柰素、异鼠李素含量不少于0.10、0.08、0.25 mg/袋作为其质量控制标准。

图3 不同批次沙棘颗粒中3个待测成分含量差异（,n=3）

3 讨论

沙棘颗粒由沙棘单味药制成，其黄酮类成分含量高，药理活性明确。本研究以槲皮素、山柰素和异鼠李素为检测对象，优化完善了薄层鉴别方法，建立了QAMS含量测定方法。

3.1 薄层鉴别条件的考察与优化

基于《中国药典》2020 年版中沙棘药材的薄层鉴别方法，结合参考文献[12-13]，增加了槲皮素和山柰素作为指标成分。因沙棘颗粒以沙棘鲜果压榨后提取合并制成，制剂中的沙棘油会干扰待测成分的分离和显色。本方法采用石油醚除油，薄层斑点明显减少且颜色更加鲜明。

在展开系统考察中，分别采用甲苯-甲酸乙酯-甲酸和正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂展开，取出，晾干，喷以1%的三氧化铝无水乙醇溶液，置紫外光灯（365 nm）下检视。通过对比待测成分的分离度，不断优化展开剂配比，选择甲苯-甲酸乙酯-甲酸作为沙棘颗粒薄层鉴别的展开系统。

选择温度（4、40 ℃）和相对湿度（18%、72%）为色谱方法学考察条件。结果表明，在上述条件下供试品、对照品的色谱斑点位置、颜色差别不大，温度和相对湿度对沙棘颗粒的薄层鉴别结果影响不大。同时考察了3个不同品牌硅胶G 板，用3%乙酸钠溶液处理后的青岛海洋硅胶G 板分离度和清晰度最佳，可满足沙棘颗粒的薄层鉴别要求。

3.2 QAMS含量测定方法建立

从提取方法、流动相种类及配比、柱温、检测波长方面系统考察了含量测定方法的分离效果。结果显示，回流提取优于超声提取；乙醇作提取溶剂时色谱峰数目少，且异鼠李素峰面积较小，参考文献[14-15]后选择甲醇与低浓度盐酸为提取溶剂；考察回流时间时发现，回流150 min 时3 个成分含量均较高，随回流时间增加，3 个成分含量呈下降趋势。流动相选择甲醇-磷酸水溶液时分离效果差，故选用乙腈-0.1%磷酸水溶液。柱温考察选择25、30、35 ℃，在35 ℃时山柰素与异鼠李素的分离效果最佳。3 个成分在365 nm 波长下均有最大吸收，因此选择365 nm 为检测波长。本研究以酸水解方式提取待测成分，故计算的槲皮素、山柰素和异鼠李素含量均以苷元计。最后，通过分析15 批样品中3 个待测成分的含量，对沙棘颗粒中槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量限度给出了参考范围。

本研究对沙棘颗粒薄层鉴别条件进行了优化，建立了以槲皮素为内参物、同时测定其中山柰素和异鼠李素含量的QAMS，从定性和定量2 个方面评价制剂质量，可为其质量标准的修订提供参考。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。