基于LNA-TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术的药用黄精掺伪研究△

王多梅，胡冲，2a，蒲婧哲，2，陈灵丽，2，杨建波，2，3，张亚中，2*，张文娟

1.安徽省食品药品检验研究院 药品检验研究所，安徽 合肥 230051；2.国家药品监督管理局 中药质量研究与评价重点实验室，安徽 合肥 230051；3.中国食品药品检定研究院，北京 102629

黄精是一种药食同源的中药资源[1-2]，具有提高机体免疫力[3]、降血糖、调血脂[4-5]、抗肿瘤[6-7]、抗菌[8]、抗病毒[9]等药理作用，其在新药研制和保健品开发等方面具有广阔的发展前景。我国黄精种质资源多样，有黄精属植物30 余种。《中华人民共和国药典》2020 年版规定药用黄精的基原为百合科植物黄精Polygonatum sibiricumDelar.ex Redoute、多花黄精P.cyrtonemaHua 和滇黄精P.kingianumColl.et Hemsl的干燥根茎[10]。然而，历代本草记载的药用黄精来源包括多种黄精属植物的根状茎，湖北黄精P.zanlanscianensePamp 作为民间习用中药，也被记载在本草典籍中[11]。湖北黄精的根茎具有润肺滋阴、补脾益肾之功效，可用于治疗体虚乏力、心悸气短、肺燥干咳、糖尿病等多种疾病。因此，市场上将湖北黄精的干燥根茎混淆为黄精的现象较为普遍。而掺假手段也并非完全替代使用，而是在黄精基原药材中掺有少量的湖北黄精或者其他黄精。现有技术仍无法解决此类掺假的定量检测问题。

形态学特征是进行黄精基原植物分类的主要依据。黄精根茎为结节状或连珠状膨大，但由于生长环境、气候条件、土壤养分及生长年限等因素的影响，即使同一种黄精生长在不同地区其形态特征也会存在一定差异，因此形态鉴别的手段往往缺乏准确性。此外，黄精属植物的显微特征及化学成分相似度极高，这使黄精属植物的物种判别缺乏特异性。

鉴于黄精属植物形态特征鉴别的局限性，分子鉴定技术被用于黄精属植物的亲缘关系研究、种质资源鉴别和遗传多样性分析[12-16]。其中锁核酸（LNA）-TaqMan 探针是在TaqMan 探针的基础上选择性对探针中的部分碱基修饰成LNA 碱基，修饰后的核糖2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥[17-18]，并连接成环形，以此提高探针与目标序列之间的亲和力、特异性和灵敏度的方法[19-20]，是目前公认的用于基因表达水平分析的重要方法，在生物医药领域得到广泛应用[21-25]。本研究应用LNA-TaqMan实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测药用黄精中湖北黄精的掺伪比例，建立相关的掺伪检测方法，为黄精的质量监管和研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Xinyi-48 型高通量组织研磨仪（宁波新艺超声设备有限公司）；HC-2066 型高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；C1000 Thermal Cycler CFX96 型荧光定量PCR 仪、CXF96 Optics ModuleI型凝胶成像仪、164-5050 型基础电泳仪、170-4486型水平电泳槽均购于伯乐生命医学产品（上海）有限公司；ME204 型分析天平 [梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]；NanoDrop One型超微量分光光度计（赛默飞世尔科技公司）。

1.2 试药

植物基因组DNA 提取试剂盒 [天根生化科技（北 京）有 限公 司]；2×M5 Super FastTaqPCR MasterMix（北京聚合美生物科技有限公司）；ExTaq™ Version 2.0、琼脂糖均购于宝日医生物技术（北京）有限公司；4S GelRed 核酸染料、DL2000 DNA Marker、引物均购于生工生物（上海）股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 样品

黄精Polygonatum sibiricumDelar.ex Redoute、多花黄精P.cyrtonemaHua、滇黄精P.kingianumColl.et Hemsl.、湖北黄精P.zanlanscianensePamp.共计34 份样品由安徽中医药大学杨青山副教授鉴定其基原。样品保存于安徽省食品药品检验研究院，具体信息见表1。

表1 黄精样品信息

2 方法

2.1 引物和探针的设计与合成

从美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载多花黄精、黄精、滇黄精、湖北黄精的trnC-petN序列，通过序列比对分析，以101 位的胞嘧啶（C）＞腺嘌呤（A）突变作为单核苷酸多态性（SNP）位点，结合Beacon Designer 8 软件分析并获得湖北黄精特异性探针。探针经过高效液相色谱法（HPLC）纯化，5＇端标记荧光素基团FAM，3＇端标记非荧光素猝灭基团BHQ1，序列为5＇-FAM-attttGatAacAcaTggc-BHQ1-3＇（小写字母表示LNA 修饰碱基）。同时利用Primer 3.0 软件设计湖北黄精特异性引物对，通过NCBI 数据库进行BLAST 同源性比对验证后，由生工生物（上海）股份有限公司合成。引物序列为Forward Primer：5＇-CAGAGGCAA AGGACTAAG-3＇；Reverse Primer：5＇-TCCCTATTG ATACCGATTTG-3＇。

2.2 DNA提取与模板制备

取根茎或叶片样品，用75%乙醇1 mL、灭菌超纯水清洗，吸干表面水分，新鲜样品置40 ℃烘箱中低温烘干水分，取约0.1 g，置球磨仪中研磨成细粉。称取20 mg，置1.5 mL 离心管中，用植物基因组DNA 提取试剂盒进行核酸提取，获得DNA 模板，利用超微量分光光度计测量模板DNA 浓度及纯度，-20 ℃保存备用。

2.3 实时荧光定量PCR反应条件优化

选取湖北黄精、多花黄精、黄精、滇黄精样品各2批，对实时荧光定量PCR条件进行优化，总反应体积为20 μL，包括PCR 反应混合液（2×）10 μL、上下游引物及探针（10 μmol·L-1）、模板DNA 1 μL。分别对体系中引物及探针的浓度及退火温度（Tm）进行反应条件优化，筛选出最佳组合条件。其中引物浓度为0.1～1.0 μmol·L-1、探针浓度为0.1～0.5 μmol·L-1，两者浓度配比筛选出最佳浓度组合；Tm值为52～62 ℃，进行梯度扩增，根据实时荧光定量PCR 扩增曲线临界循环数（Ct）值及扩增曲线形状筛选并确定最佳Tm。

2.4 专属性试验

用2.1项下实时荧光定量PCR引物及探针对表1中湖北黄精、黄精、多花黄精、滇黄精进行扩增反应，以无菌超纯水为空白对照，检验引物及探针的专属性。

2.5 适用性试验

用2.1 项下实时荧光定量PCR 探针及引物对不同产地和来源的10 批湖北黄精进行测试，检验反应体系的适用性。

2.6 重复性及精密度试验

对同一样品（编号：HBHJ-01）重复测定3 次，每次试验记录Ct值，分析组内Ct值变异系数，检测方法的重复性。同时平行测定同一批次湖北黄精（编号：HBHJ-01）样品5 份，标记1～5，记录Ct值，分析组内Ct值变异系数，进行方法精密度考察。

2.7 湖北黄精掺伪程度检测

分别取湖北黄精（编号：HBHJ-01）与多花黄精（DHHJ-01）细粉，按照表2 混合成不同掺伪比例样品，利用优化后的PCR 扩增条件进行扩增，记录不同浓度下扩增曲线Ct值大小，鉴于PCR 呈指数扩增，达到阈值时的扩增轮数为Ct值：标准品（S）与供试品（T）的Ct值之差用ΔCt表示，则样品中的目的DNA 所占比例可用2-ΔCt×100%表示，计算值与期望值比例的百分比作为回收率。本研究中S 为湖北黄精，T为不同掺伪比例样品。

表2 湖北黄精和多花黄精掺伪比例

3 结果

3.1 引物、探针浓度的确定

以湖北黄精DNA 作为模板，选择以引物浓度为0.4 μmol·L-1，探针浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40、0.45、0.50 μmol·L-1进行实时荧光定量PCR，并记录扩增曲线Ct值，结果显示探针终浓度为0.3 μmol·L-1时Ct值最小，且可获得典型的S 形扩增曲线；选择探针浓度为0.3 μmol·L-1，引物浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μmol·L-1进行实时荧光定量PCR，并记录扩增曲线Ct值，结果显示引物终浓度为0.4 μmol·L-1时Ct值最小。综上所述，选探针终浓度为0.3 μmol·L-1、引物终浓度为0.4 μmol·L-1为最佳组合浓度。

3.2 退火温度考察结果

梯度扩增结果表明，当退火温度高于62 ℃时，定量PCR 扩增曲线平坦，未出现典型的S 形扩增曲线；退火温度为58～60 ℃时，均可获得较好的扩增曲线，且58 ℃时曲线线形最好；温度低于58 ℃时，出现非特异性扩增。因此，最终确定退火温度为58 ℃。

3.3 实时荧光定量PCR优化最终条件

优化后的反应总体系为20 μL，其中包括Premix ExTaq（2×）10 μL、上下游引物（20 μmol·L-1）各0.4 μL、LNA-TaqMan探针（20 μmol·L-1）0.3 μL、模板DNA 2 μL、无菌超纯水补足。反应程序为94 ℃预变性3 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃30 s，共进行40个循环。

3.4 专属性试验结果

对表1中湖北黄精、黄精、多花黄精、滇黄精进行扩增反应结果表明，仅湖北黄精的DNA 有典型的S 形扩增曲线，而黄精、多花黄精、滇黄精的DNA均未出现扩增现象，表明引物和探针有较好的专属性。不同种黄精部分样品的典型扩增曲线见图1。

图1 不同种黄精部分样品的实时荧光定量PCR典型扩增曲线

3.5 适用性试验结果

取不同产地和来源的10 批湖北黄精按照上述体系测定。结果显示，所有湖北黄精样品均为阳性扩增，样品Ct值为20.380～22.454（表3），均值为21.502，SD为0.66，表明方法有较好的适用性。

表3 不同种黄精部分样品的荧光定量PCR适用性实验Ct值（n=3）

3.6 重复性及精密度试验结果

按照上述体系重复测定同一样品3 次，结果显示，Ct值分别为20.380、21.013、21.628，均值为21.007，SD 为0.62，组内Ct值变异系数为0.30。表明该方法重复性较好。同时，同一批的5 份湖北黄精样品Ct值分别为20.931、21.638、22.070、22.454、21.332，平均Ct值为21.685，组内Ct值变异系数为0.28。表明该方法精密度较好。

3.7 湖北黄精掺伪程度检测

不同比例混合样品经过上述体系进行实时荧光定量PCR 扩增后，经ΔCt值计算得到的相应的混合样品掺伪比例见表4。计算所得掺伪比例与实际湖北黄精含有量相近，回收率为80.72%～126.13%。结果显示，该方法在湖北黄精掺伪1%时，仍可稳定检出。

表4 不同比例混合黄精样品的掺伪程度检测结果

4 讨论

黄精作为药食同源的中药资源，市场需求量大，发展前景广阔。目前药用黄精的鉴别方法主要是化学成分研究，而黄精块茎作为其药食同源的主要部位，均为结节状或连珠状膨大，其显微特征也极为相似，成分相似度极高，传统鉴定方法容易受人为或环境因素的影响。因此，建立一种能够快速、准确的药用黄精掺伪定量检测方法尤为重要。

随着中药检测技术的发展与检测要求的提高，分子鉴定方法在中药鉴定领域的运用越来越多。目前，运用实时荧光定量PCR 及数字化PCR（dPCR）技术可以实现对检测成分的相对定量甚至绝对定量[26-27]。其中实时荧光定量PCR 具有高效率、高灵敏度、重复度好的优点，目前是公认的用于基因表达水平分析的重要方法[28-29]，已经开始逐步运用于药品检验领域[30-31]。但在药用黄精真伪性鉴定上并无相关报道。

本研究利用基于LNA-TaqMan 探针的实时荧光定量PCR 法实现对药用黄精掺伪湖北黄精的相对定量检测，利用湖北黄精与药用黄精叶绿体DNA 中trnC-petN基因间隔区序列差异设计特异性引物及LNA-TaqMan 探针，建立了实时荧光定量PCR 检测湖北黄精掺伪比例的方法。该方法相较于传统的荧光定量方法，引入了新型的核酸类似物LNA。利用设计的引物及探针测定不同混合比例湖北黄精掺伪样品，得到Ct值，通过样品与湖北黄精阳性扩增样品间ΔCt值计算，即可检测湖北黄精掺伪程度，在湖北黄精掺伪1%时仍可稳定检出，无需进行酶切或者电泳，极大减少了检验工作量，同时提高检测的准确度，缩短了检测时间，解决了化学检测手段难以鉴定掺伪比例的难题。本研究的方法能将湖北黄精与药用黄精有效区分，可为湖北黄精掺伪药用黄精定量检测提供参考。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。