马来酸-碱联合预处理稻秆制备木糖和葡萄糖

方锴莉

摘 要：以稻秆为原料，通过马来酸-碱联合预处理方法制备木糖和葡萄糖。在不同温度下比较了马来酸和硫酸对木糖回收率的影响，并对稻秆酸解后的残渣用碱脱木质素，最后进行纤维素酶水解，以释放葡萄糖。结果表明，当温度为150 ℃时，木糖的回收率最高，达72.12%。对稻秆的马来酸预处理残渣进行酶解，其葡萄糖得率仅为39.12%；在80 ℃下用2% NaOH对残渣脱木素处理12 h，酶解葡萄糖得率可提高到83.17%。

关键词：马来酸；水解；稻秆；木糖；酶解

Pretreatment of Rice Straw Using Maleic Acid Combined with Alkali for Recovery of Xylose and Glucose

FANG Kaili

（School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine， Hangzhou Medical College， Hangzhou 311399， China）

Abstract： The aim is to recover xylose and glucose from rice straw by maleic acid combined with alkali pretreatment. The xylose recovery through maleic acid and sulfuric acid pretreatment of rice straw was compared under different temperatures. Then， the residue obtained after maleic acid pretreatment was delignified by alkali. Finally， the enzymatic hydrolysis of the residue was conducted to release glucose. The maximum xylose recovery reached 72.12% when the temperature was 150 ℃. Additionally， the enzymatic glucose yield was only 39.12% after enzymatic hydrolysis of the rice straw residue. However， the glucose yield increased to 83.17% after the residue was delignified by 2% NaOH at 80 ℃ for 12 h.

Keywords： maleic acid; hydrolysis; rice straw; xylose; enzymatic hydrolysis

在我国南方地区，稻秆是一种资源丰富的农业废弃物。稻秆中碳水化合物的总含量在60%（w/w）左右，其中纤维素占33%～40%，半纤维素占20%～25%，木质素占15%～20%，另外稻秆灰分含量较多，约占干重的8%～10%。因此，稻秆在发酵糖的制备方面具有很大的应用潜能。在利用稻秆等木质纤维素原料制备生物乙醇过程中，首先需要对原料进行预处理来提高其与纤维素酶的可及度[1-3]。稀硫酸等无机强酸是常用的化学预处理试剂，但在强酸的热水解过程中，过于剧烈的水解反应条件会促使生成的戊糖降解为糠醛[4]，从而抑制后续乙醇发酵中酵母细胞的生长，导致乙醇生产的速率和得率下降[5-6]。马来酸又称顺丁烯二酸，被认为是可替代硫酸的预处理试剂，其双羧酸的结构特点与生物酶的活性催化位点结构类似，有利于维持戊糖的稳定性，在剧烈的酸预处理反应过程中降低戊糖的降解和糠醛的产生[7]。本研究比较了不同温度下马来酸和硫酸预处理稻秆对木糖回收率的影响以及碱处理脱木素对稻秆酸解残渣纤维素酶水解的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

稻秆产自浙江绍兴，经自然风干，粉碎后用30目过筛，储藏于密封塑料袋中。参考美国能源部发布的生物质化合物成分含量测定方法[8]，对稻秆进行组分分析。原料中纤维素和木聚糖分别占原料干重的35.23%和20.76%。

马来酸、硫酸和氢氧化钠，购自国药集团化学试剂有限公司；纤维素酶（C2730）和β-葡萄糖苷酶（Novozyme 188），购自Sigma公司；纤维素酶中滤纸酶活性为117 FPU·g-1，β-葡萄糖苷酶的活性为269 CBU·g-1。

CJK-0.5型快开反应釜，威海新元化工机械厂；高效液相色谱Agilent1100，美国安捷伦公司；LDZX-40SAI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；DKZ-2型电热恒温振荡水槽，上海福玛实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 稻秆的酸水解

将300 mL马来酸或硫酸水溶液加到稻秆中，搅拌均匀后转入500 mL不锈钢反应罐中，待实验装置安装完毕后用电炉进行加热。反应结束后立即卸下电爐套并且用冰水混合物冷却，待温度降至60 ℃左右，将反应罐内的物料取出，用沙星漏斗过滤，沙星漏斗内的固相用热水淋洗后再进行过滤，反复淋洗过滤5遍后将液相定容至1 500 mL，过滤淋洗后剩余的固相残渣置于105 ℃烘箱干燥24 h，称重后存于封口袋待成分分析。木糖回收率的计算公式为

式中：R为木糖回收率，%；m1为马来酸水解液中的木糖含量，g；m2为原料中的木聚糖含量，g。

用HPLC分析木糖浓度，液相色谱运行条件如下。Bio-Rad Aminex HPX-87糖柱（7.8×300 mm），以5 mmol·L-1的H2SO4为流动相，流速为0.6 mL·min-1，柱温为55 ℃，进样量为10 μL，示差折光检测器检测，外标法测定。

1.2.2 残渣的碱处理

取5 g马来酸处理所得的稻秆残渣，置于三角瓶中，加入100 mL的2% NaOH水溶液，80 ℃水浴振荡加热一定时间（4～12 h）。反应结束后将物料过滤并不断用去离子水淋洗直到洗出液pH接近中性为止，最后将处理后的物料置于50 ℃烘箱干燥备用。

1.2.3 物料的酶水解

取0.5 g碱处理后的固相残渣，加入15 FPU·g-1底物的纤维素酶和30 CBU·g-1底物的β-葡萄糖苷酶，再加入10 mL的柠檬酸缓冲液（pH=4.8）和一定量叠氮化钠（终浓度为10 mmol·L-1，防止微生物污染）。酶解温度为50 ℃，酶解时间为72 h，摇床速度为150 r·min-1。反应结束后立即将样品置于沸水中10 min，待冷却后离心，取上清液经HPLC测定葡萄糖含量。葡萄糖检测的色谱运行条件同木糖。酶解葡萄糖得率的計算公式为

式中：Y为葡萄糖酶解得率，%；n1为酶解液中的葡萄糖含量，g；n2为物料中纤维素含量，g。

2 结果与分析

2.1 不同温度下马来酸和硫酸预处理稻秆对木糖回收率的影响

鉴于温度对木质纤维原料的木糖回收率的影响最显著[9]，本文在固液比68 g·L-1，预处理时间45 min，马来酸和硫酸浓度0.17 mol·L-1的条件下，考察不同反应温度（130 ℃、150 ℃和170 ℃）对木糖回收率的影响。如图1所示，当温度为130 ℃时，硫酸水解稻秆的木糖回收率为70.67%，而马来酸水解稻秆的木糖回收率仅为36.24%，这是因为硫酸溶液中含有大量的氢离子，而马来酸羧基上的氢不能完全解离成氢离子，因此硫酸水解半纤维素产生木糖的速率比马来酸快得多。在150 ℃下，马来酸水解稻秆的木糖回收率增加到72.12%，而硫酸水解稻秆的木糖回收率降至61.78%，这是因为木糖在硫酸中的降解速率超过了木糖产生的速率。当反应温度为170 ℃时，马来酸水解稻秆的木糖回收率仍然高达71.38%，而硫酸水解稻秆的木糖回收率相比于150 ℃时大幅度下降，仅为12.43%，由此可知大量木糖在170 ℃的硫酸溶液中发生了降解。以上结果表明，在170 ℃的较高温度下，木糖在马来酸中的降解水平比在硫酸中低得多。这与LU等[7，10]的研究结果相符，即硫酸水解玉米秸秆过程中的木糖降解率是马来酸的3～10倍，马来酸水解玉米秸秆的反应活化能明显低于硫酸。由于在150 ℃和170 ℃的反应温度下，马来酸水解稻秆的木糖回收率较为接近，出于节省能耗的角度考虑，试验选取150 ℃对马来酸残渣进行预处理，然后进行后续酶解实验。

2.2 碱处理对马来酸预处理残渣酶解效果的影响

由表1可知，马来酸水解稻秆所得残渣（固液比为68 g·L-1，马来酸预处理温度为150 ℃，时间为45 min，马来酸浓度为0.17 mol·L-1）的酶解葡萄糖得率仅为39.12%；在80 ℃的碱处理温度下，用2% NaOH分别对残渣处理4 h、8 h和12 h，各碱处理物料的酶解葡萄糖得率分别为54.72%、76.86%和83.17%。这是因为碱处理有利于残渣中木质素的脱除，破解了木质素对纤维素酶水解的物理屏障，增加了底物的孔隙率或纤维素酶的可及性[11-12]；碱处理时间越长，物料中的木质素含量越少，从而越有利于纤维素的酶水解[13]。如图2所示，不同碱处理时间下所得稻秆的木质素含量和酶解葡萄糖得率之间具有较强的线性相关性（R2=0.974 5），表明木质素脱除促进了纤维素的酶解，这与前人的研究结果一致[14-15]。

3 结论

本试验结果表明，当马来酸的预处理温度为150 ℃时，木糖的回收率最大，达72.12%。在170 ℃的较高温度下，木糖在马来酸中的降解水平比在硫酸中低得多；对稻秆酸解残渣进行NaOH脱木素处理，可以大幅度提高物料的酶解葡萄糖得率，且底物中木质素含量和葡萄糖得率呈现较强的线性关系。

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