银杏果淀粉酶解条件研究

2016-11-25杨冬梅王艳张学兵胡佳琪

科技视界 2016年25期

杨冬梅　王艳　张学兵　胡佳琪

【摘要】为了研究银杏果实中淀粉水解的条件，分别采用液化酶和糖化酶对银杏果实中的淀粉进行酶解试验，考察不同工艺条件（如温度、时间、用量）对液化酶、糖化酶酶解银杏淀粉效果影响。结果表明：液化酶最佳酶解工艺条件：液化温度60℃、液化时间30min、液化酶添加量0.03%；糖化酶最佳酶解工艺条件：糖化温度60℃、糖化时间90min、银杏浆液糖化酶添加量0.01%，最后的酶解率可达到74%。该课题的研究为银杏饮料的研究奠定了一定的基础。

【关键词】银杏果；淀粉；酶解

Hydrolysis Conditions of Enzyme on Starch in Gingko

YANG Dong-mei WANG Yan ZHANG Xue-bing HU Jia-qi

（Wan Xiang polytechnic，Hangzhou Zhejiang 310023，China）

【Abstract】In order to explore the conditions of enzymolysis of starch in gingko，liquifying enzyme and saccharifying enzyme were used to catalyze amylolysis respectively， and the proper temperature，time and dosage were studied.Results showed that the optimum conditions were：for liquifying enzyme，60℃，30min，0.03%；and for saccharifying enzyme，60℃，90min and 0.01%.

【Key words】Gingko；Starch；Enzymolysis

银杏（Ginkgobiloba L.）系侏罗纪的孑遗植物，素有裸子植物的“活化石”之称，为世界珍贵的药食兼用的植物资源[1]。银杏果，又名白果，内含多种生物活性营养物质，每100g干果中含蛋白质13.4g、脂肪3g、碳水化合物71.2g、钙19.6mg、胡萝卜素0.2mg、硫胺素0.44mg、尼克酸2.6mg，另外还含有少量的赤霉素和细胞分裂素等[2]。虽然银杏果在中国的食用历史已有1000余年历史，但一直以来，银杏果吃法仅限于制作成家庭菜肴，未有进行深加工开发，且这种家庭做法往往不能保证将其中的微量氢氰酸破坏，偶尔会造成中毒现象的发生[3]。近年来，银杏果的深加工已经被重视起来，银杏果酒、银杏叶饮料、银杏果脯等发面的研究，但是将银杏果制作成饮料的研究并不多见。这是因为银杏果实富含淀粉，淀粉经加热后大多以糊化的状态存在，糊化的淀粉易老化而产生混浊或分层沉淀，而且不易过滤，制成饮料后稳定性差。因此，如何解决银杏果实中淀粉等大分子物质的溶解性问题，将是关系到饮料品质的关键因素。

本试验采用液化酶、糖化酶酶解银杏果淀粉，使其中的淀粉含量减少，可溶解的成分增加。淀粉酶解产生的糊精和糖类都有良好的溶解性，还原糖在固体饮料中往往充当着分散剂的作用，对于改善产品的冲调性也有明显作用，这样银杏果饮料的稳定性就大大的提高了。

1 材料与方法

1.1 材料

银杏果：市售，购买后放冰箱中冷藏；

阿拉丁α-中温淀粉酶（4645.76μ＼ml）、

阿拉丁糖化酶（99600μ＼ml）、可溶性淀粉、碘、碘化钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、糊精、淀粉、冰醋酸、醋酸钠、盐酸、氢氧化钠、DNS试剂

1.2 实验仪器

HH-S21-4-S（新苗）恒温水浴锅、pHS-3C数字酸度计、TGL-16G台式离心机、TM-768打浆机、772型可见分光光度计、分析天平、电炉。

1.3 银杏浆液制备

新鲜银杏果→预煮20分钟→去壳去皮去芯→打浆（料水比1：6）→放冰箱储存。

本实验银杏浆液打浆时，采用巴氏杀菌后的冷水打浆并尽量在48小时内使用完。打浆后的银杏浆液较为粘稠，颜色呈乳白色略带浅黄色。计量方式采用称重。

1.4 实验方法

本次实验首先采用可溶性淀粉为反应底物，测得其酶活性为实验提供基础依据并对其用量进行粗略的预测。再以银杏进行酶解条件研究。

1.4.1 α-淀粉酶活力测定[5]

α-淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1，4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失。其颜色消失的速度与酶活力有关。故可以通过固定反应的时间计算其酶活力。

取2mL标准终点溶液（标准糊精溶液与标准稀碘液）于白瓷板空穴内，作为比较终点颜色的标准。取5.5%可溶性淀粉20mL和pH6.0磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液5mL装入大试管中，在60℃恒温水浴中预热4～5min.然后加入预先稀释好的α-淀粉酶酶液0.5mL，立即记录时间，充分摇匀，定时用吸管取出反应液0.5mL，滴于预先充满稀碘液（约1.5mE）的白瓷板空穴内，当穴内颜色由蓝紫色渐变为棕红色，与标准终点色相同时，即为反应终点，并记录时间。

1.4.2 糖化酶活力测定

糖化型淀粉酶（即淀粉-1，4-葡萄糖苷酶，简称糖化酶）能将淀粉从分子链非还原性末端开始，分解a-1，4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。糖化酶的活力：用1g固体酶粉（或1ml液体酶），于40℃、pH值为4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，为1个酶活力单位，以u/g（u/ml）表示[6]。故可以通过一定时间内产生的葡萄糖计算其酶活力。

吸取液体酶1.00ml移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（估计酶活力在100～250u/ml范围内），摇匀。测定于甲、乙两支50ml比色管中，分别加入可溶性淀粉25ml及缓冲液5ml，摇匀后，于40℃恒温水浴中预热5min。在甲管（样品）中加入待测酶液2ml，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立刻各加入氢氧化钠溶液0.2ml，摇匀，将两管取出迅速冷却，定容到250ml，取1ml使用DNS法测得其葡萄糖含量。

1.4.3 银杏浆液酶解

准确称取银杏浆液40g于小烧杯中，蒙上保鲜膜，沸水浴灭菌5分钟，冷却，预热。准备已经用缓冲液稀释好的α-淀粉酶酶液，在恒温水浴锅中，预热5分钟后，加入小烧杯中。完成酶解后，沸水浴灭菌5分钟，冷却，加入稀HCl将酶液调节至4.25左右，预热。准备已经用缓冲液稀释好的糖化酶酶液，在恒温水浴锅中，预热5分钟后，加入小烧杯中。完成酶解后，沸水浴灭菌5分钟，冷却。

1.4.4 DNS法测定总糖和还原糖 [7]

1）样品中含糖量（OD值）的测定

样品葡萄糖的含量检测：

将酶解好的银杏浆液定容的100ml，取一部分进行离心后，取上层清液10ml定容到100ml，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍，用于还原糖的测定。

样品总糖的水解及提取：

准确称取15g银杏浆液，放在小烧杯中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸馏水15ml，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如果已经水解完全，则不呈现蓝色。水解完成后，冷却至室温加入1滴酚酞指示剂，以NaOH稀溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍，用于总糖测定。测定后，取样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的糖量。

2）结果处理

按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量：

2 结果与讨论

银杏果。又名白果，内含多种生物活性营养物质，每100g干果中含蛋白质13.49g、脂肪3g、碳水化合物71.2g、钙19.6mg、胡萝卜素0.2mg、硫胺素0.44mg、尼克酸2.6mg，另外还含有少量的赤霉素和细胞分裂素等，另外含有17种氨基酸、白果醇（10-廿九烷醇）、白果酮、廿八醇、B-谷甾醇、豆甾醇、生物碱等[8]。银杏种仁中淀粉占了种子成分干重的很大一部分，这种组分也是导致银杏果饮料不稳定的主要因素，因此，选用酶将它降解成适当相对分子质量的物质，以提高它们的溶解性。

2.1 α-中温淀粉酶条件筛选

淀粉酶分为内切酶、外切酶、糖化酶等，本实验选用的α一淀粉酶是一类内切酶，它从分子内部任意切开α-1，4葡萄糖苷键，生成大分子糊精和低聚糖，达到使淀粉液化的目的[10]。

DE值表示淀粉的水解程度或糖化程度。糖化液中还原性糖全部当作葡萄糖计算，占总糖的百分比即为DE值。因此，需要计算出银杏果中的总糖含量。

实验采用酸水解[9]的方法将银杏果中的糖类全部水解后，采用DNS法测出其中的糖含量，测得1：6的银杏浆液中含总糖的量为2.151mg/ml。

2.1.1 α-中温淀粉酶用量

虽然对于α-中温淀粉酶的活性做了大概的预测，但是运用在银杏淀粉上会有一些差异，因此，需要对其进行多次试验，先从大范围到小范围进行筛选，最后得到最适宜的用量。实验中为了避免银杏浆液中本来就存在的还原糖或其他的原因会引起实验误差，本实验还设计了空白实验。实验中的空白对照，对照组中在未加入α-中温淀粉酶酶液。以便更好的了解各种介质条件对于酶解的影响。

实验中共分为5个样品，α-中温淀粉酶酶液用量为0.8ml、1.0ml、1.3ml、1.6ml，酶解温度为60℃，酶解时间为60min，糖化酶酶解温度为60℃，用量为0.4ml，酶解时间为60min。DE值是溶液中还原糖占总糖含量的比值，当溶液中DE值增大时，表明其中的一部分不可溶解的淀粉或者糊精等酶解成了可溶解的还原糖，这样使用DNS法就能通过检测出的DE值，得出银杏浆液中淀粉是否被酶解以及被酶解的程度，筛选出更为适宜的酶解条件。

实验证明，酶液的用量对于酶解程度有很大的影响，溶液中DE值随着α-中温淀粉酶使用量增大而增大，当α-中温淀粉酶使用量达到1.3ml以后，DE值就不再增加了。说明淀粉分子能被α-中温淀粉酶切断的已经全部被切断。因此，选择α-中温淀粉酶酶液的使用量为1.3ml进行酶解。

2.1.2 α-中温淀粉酶温度

通过一些资料及预实验，将温度设计为50℃、60℃、70℃、80℃，酶液用量为1.3ml，酶解时间为60min，糖化酶酶解温度为60℃，用量为0.4ml，酶解时间为60min。对比酶解后的DE值得到的最佳的酶解温度。酶解时，温度的控制采用温度计。由于温度相差较小时，差别不大，因此，选用10℃的间隔。

实验证明，温度对于酶解的程度影响较大，当温度过高或过低时，都会影响酶解的效果。当温度达到70℃以上时，酶的活性大部分都被抑制，DE值只达到了46.9%，当酶解温度为60℃时，银杏淀粉被酶解程度最高DE值为69.1%，因此，选择α-中温淀粉酶酶液的酶解温度为60℃进行酶解。

2.1.3 α-中温淀粉酶酶解时间

通过预实验预测酶解时间20min-60min左右达到最佳，故将酶解时间设计为20min、30min、40min、50min，酶液用量为1.3ml，酶解温度为60℃，糖化酶酶解温度为60℃，用量为0.4ml，酶解时间为60min。对比酶解后的DE值得到最佳的酶解时间。

由表3中可知，酶解20min后溶液中的还原糖含量达到总糖含量的48%，酶解30min后溶液中的还原糖含量达到总糖含量的55.3%，相比较未加入α-中温淀粉酶的空白试验提高了19%。当酶解时间达到30min以上时，DE值不再增加。因此，α-中温淀粉酶酶液酶解最佳时间设为30min。

2.2 糖化酶条件筛选

α-中温淀粉酶只能将淀粉分子链中的α-1，4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，单一使用α-中温淀粉酶酶解效率较低，而糖化酶能将淀粉从分子链非还原性末端开始，分解a一1，4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。因此，采用糖化酶配合酶解。

2.2.1 糖化酶用量

通过预实验预测，糖化酶酶液酶解时用量为0.8ml、1.0ml、1.3ml、1.6ml，酶解温度为60℃，酶解时间为60min，α-中温淀粉酶酶解温度为60℃，用量为1.3ml，酶解时间为30min。本实验设计的空白实验，对照组中在未加入糖化酶酶液。可利用空白中的值来反映酶解试验是否有效，以及糖化酶在整个酶解过程中作出的贡献占比。酶解时，采用稀HCl溶液将pH值调节至4.25左右，并每隔5分钟进行摇晃，根据最后的DE值，筛选出更为适宜的酶解条件。

由表4中可见，酶液的用量对于酶解程度有很大的影响，溶液中DE值随着糖化酶使用量增大而增大，当糖化酶使用量达到0.8ml以后，DE值就几乎不再增加了。0.8ml用量糖化酶酶解后银杏浆液的DE值为67.7%，相比较α-中温淀粉酶酶解DE值有了比较明显的增加，1.0ml用量糖化酶酶解后银杏浆液的DE值为67.8%，0.8ml用量的效率比较高，因此，选择糖化酶酶液的使用量为0.8ml进行酶解。

2.2.2 糖化酶酶解时间

通过资料查找的预测酶解时间30-120min时左右达到最佳，故将酶解时间设计为30min、60min、90min、120min，酶液用量为0.8ml，酶解温度为60℃，α-中温淀粉酶酶解温度为60℃，用量为1.3ml，酶解时间为30min。对比酶解后的DE值得到最佳的酶解时间。

2.2.3 糖化酶酶解温度

通过一些资料及预实验，将温度设计为50℃、60℃、70℃、80℃，酶液用量为0.8ml，酶解时间为90min，α-中温淀粉酶酶解温度为60℃，用量为1.3ml，酶解时间为60min。对比酶解后的DE值得到的最佳的酶解温度。酶解时，温度的控制采用温度计。由于温度相差较小时，差别不大，因此，选用10℃的间隔。

实验证明，温度对于酶解的程度影响较大，当温度过高或过低时，都会影响酶解的效果。当温度达到80℃以上时，酶的活性被抑制，DE值只达到了53.0%，当酶解温度为60℃时，银杏淀粉被酶解程度最高DE值为73.8%，因此，选择糖化酶酶液的酶解温度为60℃进行酶解。（见表6）

表6 糖化酶的酶解温度对银杏淀粉酶解的影响

Tab.6 Effect of saccharifying enzyme α-amylase enzymolysis temperature on ginkgo starch

3 结论

经过α-中温淀粉酶和糖化酶的酶解后，银杏浆液中的可溶性物质增加，沉淀物降低，稳定性提高，银杏浆液相较于未酶解时澄清，香味更浓郁。酶解DE值提高至70%以上。

通过单因素实验，已确定双酶法酶解银杏淀粉的条件。液化酶最佳的工艺条件：液化温度60℃、液化时间30min、银杏浆液液化酶添加量0.03%。糖化酶最佳的工艺条件：糖化温度60℃、糖化时间90min、银杏浆液糖化酶添加量0.01%，酶解率能达到74%（DE值）。

【参考文献】

[1]宋永芳.银杏的化学成分和用途[J].林产化学与工业，1986（3）：91-94.

[2]梁立兴.中国当代银杏大全[M].北京：北京农业大学出版社，1993.

[3]李先光.婴幼儿白果中毒36 临床例分析[J].中国中医药资讯，2010，2（30）：71-72.

[4]银杏热中的冷思考[C].中国绿色时报，2000.

[5]姜锡瑞，段钢.新编酶制剂实用技术手册[M].北京：中国轻工业出版社，2002.