脯氨酸丹参素冰片酯对小鼠中枢神经系统的一般药理学研究

秦蓓 王荣 余丽丽 张怡心 谭雄 王娜娜

(西安医学院1.西安市多靶协同抗高血压创新药物研制重点实验室2.药物研究所3.药学院,陕西 西安 710021)

高血压是临床常见的心脑血管疾病之一,据调查我国成人高血压的患病率约为23.2%[1]。药物治疗是高血压控制的关键,血管紧张素转化酶抑制剂是高血压防治的一线药物。课题组以普利类药物结构设计为基础,基于“组合中药分子化学”研究策略[2],设计筛选得到了一个具有自主知识产权(RU2685709C2)的候选药物分子—脯氨酸丹参素冰片酯,其化学名为(S)-1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-基-1-[(S)-2-((R)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酰氨基)丙酰基]吡咯烷-2-羧酸酯[3],结构如图1。在该分子结构中间的二肽结构是普利类药物的母核结构,该部分母核结构的存在使其能够与血管紧张素转化酶有效作用。二肽脯氨酸端通过酯键与右旋龙脑(冰片)结合,冰片具有芳香开窍作用[4],可以协助药物分子通过血脑屏障,直接作用于大脑,同时降低传统普利类药物在肺部富集引起干咳的问题[5]。二肽的丙氨酸端与丹参素通过更为稳定的酰胺键结合,丹参素可以实现协同降压的同时起到了保护血管[6]、心脏[7]、肾脏[8]等脏器的作用。前期研究显示,脯氨酸丹参素冰片酯可作用于肾素-血管紧张素-醛固酮系统系统发挥降压效果,在此基础之上,为进一步评价该化合物的安全性,考察脯氨酸丹参素冰片酯对中枢神经系统的影响,为其临床应用提供安全性方面的实验数据。

图1 脯氨酸丹参素冰片酯的结构

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级KM健康小鼠,体重(20 ± 2)g,雌雄各半,购自西安交通大学医学部实验动物中心,实验动物许可证号:SYXK(陕)2020-005。动物雌雄分笼饲养于屏障系统独立通气笼中,自由饮用高压灭菌水,60Co放射灭菌鼠颗粒饲料喂养,环境温度(25 ± 5)℃、湿度(50 ± 10)%。

1.2 药品与试剂脯氨酸丹参素冰片酯(自制,白色结晶,高效液相色谱法测定含量为97 %);羧甲基纤维素钠(CMC-Na)(河南胜久实业有限公司);戊巴比妥钠钠(美国Merck,批号:191204);醋酸。以0.5 % CMC-Na溶液为溶剂配置不同浓度药物溶液。

1.3 实验仪器YLS-4C转棒式疲劳仪,YLS-6B智能热板仪,YLS-1C动物自由活动仪(均购自济南益延科技发展有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠一般行为和自主活动观察小鼠适应性喂养后随机分为对照组和脯氨酸丹参素冰片酯大剂量(120 mg/kg)、中剂量(60 mg/kg)和小剂量(30 mg/kg)给药组,每组10只,雌雄各半。试验前禁食12 h,自由饮水,分别灌胃给予相应药物,对照组灌胃等量溶剂。给药前及给药后10、30、60、90、120、180 min将小鼠放至自主活动记录仪,记录小鼠5 min内自主活动次数,并观察小鼠的一般行为。

1.4.2 小鼠协调运动实验小鼠分组及给药同1.4.1,分别采用转棒法和金属网法考察脯氨酸丹参素冰片酯对小鼠协调运动能力的影响。(1)转棒法:实验前小鼠于转棒仪转杆训练3 d,转速40 rpm/min。记录给药前及给药60 min后小鼠从转棒仪转杆上掉落所用时间。(2)金属网法[9]:给药后将小鼠放置于与桌面呈50°的金属网上任其攀爬,记录给药前及给药后60 min后各组小鼠从金属网上掉落使用的时间。

1.4.3 小鼠睡眠协同作用试验小鼠分组及给药同1.4.1。小鼠灌胃给药30 min后,腹腔注射戊巴比妥钠(阈下和阈睡眠剂量分别为30 mg/kg和45 mg/kg)[10-11],观察30 min内小鼠翻正反射消失情况(小鼠四肢朝上仰卧1 min没有翻转过来即为进入翻正反射消失阶段),超过1 min以上即为睡眠动物。以翻正反射消失为睡眠指标,计算入睡潜伏期(从注射戊巴比妥钠开始到翻正反射消失之间所用的时间)和睡眠持续时间(翻正反射消失到翻正反射恢复所用的时间)。计算睡眠发生百分率,入睡率(%)=入睡动物数/动物总数×100%。

1.4.4 小鼠镇痛作用试验小鼠分组及给药同1.4.1,分别采用热板法和醋酸扭体法考察脯氨酸丹参素冰片酯的镇痛作用。(1)热板法:热板仪调至(55±0.5)℃,小鼠置于热板上,以小鼠舔后足作为痛觉指标,记录小鼠出现舔后足的时间作为痛阈值。记录给药前和给药后60、120、180 min小鼠的痛阈值。(2)醋酸扭体法:给药后24 h,每只小鼠腹腔注射1 %醋酸0.2 mL/10 g,小鼠腹部出现内凹、躯干与后肢伸张,臀部高起等行为被认定发生一次扭体反应。观察10 min内小鼠出现扭体反应的次数及出现扭体的时间。

2 结 果

2.1 药物的来源实验药物由课题组自主设计合成。该药物的合成以冰片、Boc-L-丙氨酸、Boc-L-脯氨酸、丹参素为原料,合成过程通过了酯化缩合、脱叔丁氧酰基、酰胺化缩合、脱叔丁氧酰基、酰胺化缩合五步反应。产物最终通过柱层析分离和重结晶联合的方法进行纯化研究,路线产率可达30%以上。纯化后产物的色谱纯度达到99.8%以上,适合用于后期的成药性研究。

2.2 各组小鼠自主活动情况各组小鼠姿势、步态等一般行为均正常。与对照组相比,脯氨酸丹参素冰片酯大剂量、中剂量和小剂量组在10～180 min内小鼠的自主活动逐渐降低,且在120 min时自主活动次数最少。与给药前相比,脯氨酸丹参素冰片酯大剂量、中剂量和小剂量组对小鼠自主活动次数无显著影响(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠自主活动情况对比次,n=10]

2.3 各组小鼠协调运动能力情况转棒法:与对照组相比,脯氨酸丹参素冰片酯大剂量、中剂量和小剂量组小鼠在棒时间无显著性差异;与给药前相比,脯氨酸丹参素冰片酯大剂量、中剂量和小剂量组小鼠在棒时间均有延长趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。金属网法:给药前各组小鼠从金属网上掉落时间差异无统计学意义(P>0.05);给药后,与对照组相比,脯氨酸丹参素冰片酯大剂量、中剂量和小剂量组显著延长了小鼠从金属网上掉落的时间(P<0.05);与给药前相比较,脯氨酸丹参素冰片酯对小鼠在网攀爬时间无显著影响(P>0.05)。见表2。

表2 各组小鼠协调运动能力对比

2.4 各组小鼠入睡情况各组小鼠分别灌胃给药后给予戊巴比妥钠阈下和阈剂量,与对照组相比,脯氨酸丹参素冰片酯大剂量、中剂量和小剂量各组小鼠的入睡只数、睡眠潜伏期和睡眠持续时间比较差异均无统计学意义(P>0.05) ,表明脯氨酸丹参素冰片酯对小鼠入睡潜伏时间和睡眠时间无明显影响。见表3。

表3 各组小鼠入睡情况比较

2.5 脯氨酸丹参素冰片酯镇痛作用比较热板法:与对照组相比,脯氨酸丹参素冰片酯大剂量、中剂量和小剂量各组小鼠的痛阈值差异无统计学意义(P>0.05);与给药前相比,脯氨酸丹参素冰片酯各剂量组小鼠的痛阈值差异无统计学意义(P>0.05)。醋酸扭体法:与对照组相比,脯氨酸丹参素冰片酯大剂量、中剂量和小剂量对醋酸所致小鼠疼痛无显著影响,其扭体反应出现的时间和次数差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 脯氨酸丹参素冰片酯对各组小鼠痛阈值的影响

3 讨 论

一般药理学也称安全性药理学,其目的是研究药物在治疗或治疗范围以上时,潜在的不希望出现的对生理功能的不良影响[12]。一般药理学观察包括中枢神经系统、呼吸系统和心血管系统等方面。在新药研发过程中,一般药理学与急性毒性、长期毒性是对药物进行安全性评价的重要组成部分。脯氨酸丹参素冰片酯是本课题组研发的具有自主知识产权的抗高血压药物,但其对中枢神经系统的影响尚未见研究,其安全性及潜在受累靶器官尚不清楚。

本研究采用经典的中枢神经系统药理实验方法,如自主活动记录、转棒法、协同睡眠法等,评价,脯氨酸丹参素冰片酯对小鼠自主活动、协同睡眠、协调运动能力等的影响。结果显示,脯氨酸丹参素冰片酯对小鼠一般行为和自主活动方面无显著影响;对戊巴比妥钠的睡眠作用不具有协同或累加效应;脯氨酸丹参素冰片酯对不具有镇痛作用。在小鼠协调运动能力方面,脯氨酸丹参素冰片酯显著延长了小鼠在网攀爬时间,但对小鼠在棒时间无显著影响,故认为此现象与药物毒性作用无关。以上研究表明,脯氨酸丹参素冰片酯在治疗量或较高剂量时,对小鼠中枢神经系统无显著影响。本研究提供了脯氨酸丹参素冰片酯安全性试验数据,为其进一步研究开发提供了理论依据。

利益冲突说明/Conflict of Intetests

所有作者声明不存在利益冲突。

伦理批准及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究通过陕西西安医学院医学伦理委员会批准(批准号:XYLS2022053),为动物实验故免除知情同意。